【2019年整理】发酵生产琥珀酸的研究进展(20210125151724)

1、题目发酵生产琥珀酸的研究进展 姓名吴志洪 所在学院化学与化工学院 专业生物工程 学号0908110342 日期2012 年12月10日 发酵生产琥珀酸的研究进展 摘要近年来，因瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌 Acti no bacillus succinogenes具有高的琥珀酸产量，并能够利用多种碳源进行发酵等 优点，在利用发酵法生产琥珀酸领域具有广泛的应用前景和商业化价 值，因而其代谢途径和发酵工艺等基础研究成为国内外研发的热点。 近年来，人们在产琥珀酸放线杆菌的代谢途径、琥珀酸发酵动力学模 型、新型经济培养基以及高产菌株选育等方面的研究取得了很大进 展，对研发琥珀酸发酵工艺、降低生产成本和节

2、能减耗等具有重要的 理论意义。 关键词；琥珀酸、发酵、产琥珀酸放 1琥珀酸的简介 1.1琥珀酸，学名丁二酸它是一种重要的有机合成中间体，主要应 用于食品、医药、生物降解甥料、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂和 动植物生长刺激物等领域1。目前，通过发酵法生产得到的琥珀酸， 其价格大约为0. 55 1. 10$/kg2 图1-1 丁二酸的分子结构 1.2它是厌氧代谢的发酵产物之一琥珀酸广泛应用于医药、农药、 染料、香料、油漆、食品、塑料等行业，也可以作为C4平台化 合物，合成一些重要的化工产品如丁二醇、 四氢咲喃、丫 - 丁内酯、 n-甲基吡咯烷酮（NMD）、2-吡咯烷酮等，全世界市场需求量超过 27

3、6000 t/a. 1.3 利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖 , 木糖等）生产琥珀 酸, 由于原料来源广泛且价格低廉 , 污染小, 环境友好 , 且在发酵 过程中可吸收固定 CO2, 能有效缓解温室效应 , 开辟了温室气体二氧 化碳利用的新途径 , 近年来成为研究的热点 3-4 。 2 生物发酵法制备丁二酸 2.1 发酵菌种 丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物。 一般情况下， 丙酸盐生产菌、 典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌能够分泌 丁二酸。据报道，一些乳酸菌 （LactobaciIlus） 也能在特定的培养基 上不同程度地产生丁二酸。 国外在 20世纪90年代就开始发酵生

4、产丁二 酸的研究， 目前报道的发酵产丁二酸的菌种主要 Anaerobiospirillum succiniciproducens 4、 Actinobacillus succinogenes 5 、 Mannheimia succiniciproducens 6和另外还有如 Corynebacterium glutamicum 、 Mannheimia succiniciproducens 7 等菌种。由于天然菌株的产丁二酸能力非常低，发酵产物多种多样， 对糖或丁二酸的耐受性比较差， 因此必须运用生物工程技术对现有的 菌种进行 8 。 2. 2 重组大肠杆菌产发酵丁二酸 野生大肠杆菌产丁二酸的

5、代谢途径：一般认为，野生型E. coli 在有氧环境中 , 琥珀酸仅作为 TCA 循环中的中间产物 , 没有积累 ;但在厌氧环境下，进行混合酸发酵（图1）,并认为存在六条途径可 以代谢生成琥珀酸（图2）。其中，琥珀酸主要的产生途径为葡萄糖 经过糖酵解途经生成磷酸烯醇式丙酮酸，并进而代谢合成草酰乙酸、 苹果酸、富马酸，最终以琥珀酸的形式积累。在此合成途径中，每1 mol葡萄糖生成2 mol NADH,生成1 mol琥珀酸需要消耗2 mol的 NADH,而生成乳酸、甲酸和乙酸则只需消耗1mol的NADH甚至不需要 消耗NADH,因此，在野生大肠杆菌中，琥珀酸由于需要更多的还原 力，积累很少。 Ma

6、late f um Fumarate 1/2 Glucose PEP PTS Pvruva.te NAOH Foniule JATT NADH NAE+ Accta Idel ly de Fth anol Acetyl-P frdAOP a Succinate Acetate A3P ALT 图1大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径9 Fig. 1 Pathways of an aerobic mixed acid ferme ntatio n for Escherichia coli PEP 4 Isoeitrale 图2大肠杆菌K-12发酵产丁二酸途径 Fig. 2 Pathways for the

7、 formatio n of the ferme ntati onproduct succi nate inEscherichia coli K-1213 Note: 1: PEP carboxyk in ase; 2: Malate dehydroge nase; 3: Fumarase;4: Fumarate reductase; 5: PEP carboxylase; 6: Aspartate: glutamate transaminase; 7: Aspartase; 8: Succinic semialdehyde dehydroge nase; 9: y -aminobutyrat

8、e: glutamate transaminase; 10: Glutamate decarboxylase; 11: Isocitrate lyase 10 3产琥珀酸大肠杆菌基因改造策略： 3.1增强琥珀酸代谢途径中关键酶： a超量表达内源性基因：苹果酸酶催化苹果酸与丙酮酸之间的反 应, 正常生理条件下该酶催化动力学上有利的苹果酸转化为丙酮酸的 正向反应 , 但苹果酸酶在特定的菌种中有可能催化从丙酮酸到苹果 酸的逆向反应 , 原因是该反应方向在热力学上是有利的。 大肠杆菌中 编码苹果酸酶的基因sfcA,在E. coli双突变株NZN111中超量表达 后, 由于该菌株缺乏乳酸脱氢酶和丙酮酸甲

9、酸裂解酶活性 , 导致丙 酮酸的大量积累 , 使苹果酸酶逆向催化生成苹果酸 , 并以琥珀酸作为 最终还原产物而大量积累。 PEP羧化酶基因（ppc）和PEP羧化激酶基因（pck）催化PEP与草 酰乙酸（OAA）之间的反应。Millard等人发现PEP羧化酶可能是大肠杆 菌厌氧混合酸发酵中催化PEP至OAA最主要的酶，而当ppc缺陷时, PEP 羧化激酶可催化该反应。 富马酸还原酶是厌氧琥珀酸合成途径中另外一个关键酶 , 其核 苷酸序列、氨基酸序列与琥珀酸脱氢酶相似 , 均可催化富马酸与琥珀 酸之间的反应 ,仅与底物之间的亲和力有所差异。 3.2 b 引入外源性基因： 在大肠杆菌中过量表达内源性

10、基因取得了很好的效果 , 且由于 稀有密码子少等原因容易表达 , 但发展空间较小 , 目前很多研究者 尝试在E. coli中引入外源基因，尤其是大肠杆菌自身不含的酶基因 来构建新的代谢途径（如pyc基因）以提高琥珀酸收率及生产强度。 3.3 敲除或失活琥珀酸竞争途径中的酶： 野生型大肠杆菌厌氧混合酸发酵过程中主要产物为乳酸 , 甲酸 和乙酸, 若要获得高浓度的琥珀酸积累 , 则必需减少这些副产物的生 成 , 使更多的代谢流流向琥珀酸 11 。 4 重复批次发酵简介 重复批次发酵， 即在发酵结束后回收发酵液中的细胞， 转入新鲜 培养基，继续发酵，进行重复批次生产。重复批次发酵可以延长了菌 体的发

11、酵时间，提高了产物的总产量，达到了细胞重复利用的效果。 重复批次发酵在乙醇生产过程中应用较多。大肠杆菌发酵丁二酸后 期，由于产物抑制作用，产物增加不再明显，但是细胞仍具有较高发 酵能力。因此，回收细胞，进行重复批次发酵具有重要意义。 根据丁二酸发酵液的主要特点， 回收发酵液中菌体， 进行了重复 批次发酵。 每批次发酵采用细胞转化的方法， 即将回收的细胞悬浮无 菌水中，仅补加葡萄糖和碳酸镁，然后进行厌氧发酵，并考察了细胞 浓度、初始葡萄糖浓度、 pH 调节剂对细胞转化的影响。相比于两阶 段发酵，细胞转化节约了氮源和细胞生长期的能量消耗。 重复批次转 化循环利用菌体，延长丁二酸发酵时间，提高丁二酸

12、总产量，有利于 丁二酸的工业化生产 . 5 化学合成培养基及优化 为了达到某种日的，需要设计专门的培养基来满足实验要求。 AM3 培养基就是为了研究产琥珀酸大肠杆菌的代谢途径而设计的培 养基，McKinlay等12比较了 AM3培养基与富集培养基中该菌的生长和 产物形成情况，并研究了 NaHC，O 对产物的形成、菌体生长及代谢效 率的影响。结果表明，低浓度的NaHCO对其影响较大，而高浓度基 本没有影响，当浓度在25mmoJ/L时，菌体生长速率最大。 国内在培养基设计方面也做丁不少努力，郑璞等 13 利通过响应面 分析法对Act in obaciUus succi noge nesCGMCC5

13、93所用发酵培养基进 行了优化，并分析了碳源和氮源物质对琥珀酸产生的影响，并H该菌 在优化后的培养基中琥珀酸的产量达到了 41. 699/L。另外，玉米皮 14啤酒废酵母酶解液 |15 也被用来作为发酵培养基的成分， 琥珀酸产量 与合成培养基相当。 6 高产菌株的筛选 高产菌株的选育主要是通过诱变和驯化的方法对原菌株进行操 作，并对选育出的高产菌株做稳定性实验验证， 最终确定高产菌株的 筛选结果。 诱变法具有不定向性， 可能通过阻断或改变琥珀酸及副产 物的代谢途径，从而得到高产且副产物较少的荫株。 一项研究表明 16， 经过NTG诱变并利用氟乙酸作为选择压力筛选出的 SF-9菌株琥珀产 量叮以

14、达到35. 09/L,比出发菌株增加21. 4%,同样乙酸的产量有 所下降。 7 展望 产琥珀酸大肠杆菌作为一株很具发展前景的产琥珀酸菌株, 以其 独特的优势成为国内外的研发对象。 口前,产琥珀酸大肠杆菌发酵生 产琥珀酸存在产物抑制和基因改造工具缺乏两个难题,阻碍r 琥珀酸 产量的进一步提高。 在今后的工作中, 可以从以下几个方面着手进行 解决。 (1) 发展发酵与分离耦合工艺,及时将产物转移出来,从而消 除或减弱产物抑制。 (2) 通过诱变和驯化的方法筛选高耐受性菌株。 (3) 深入研究产琥珀酸大肠杆菌的代谢途径及关键酶的表达调控机 制。(4) 构建表达载体，利用代谢途径构建工程菌，提高琥珀

15、酸产量。 总之，随着研究的不断深入， 发酵法将成为工业化生产琥珀酸的主要 方法，并且有望取代化学合成方法。 参考文献 1 詹晓jb，朱一晖，Wang|)0ng. ai .琥珀酸发酵生产工艺及其产 品f仃场.食I协科技，2003(2) :“ -49 2 McKinlay J B ， Vieille C ， Zeikus J G . Prospects for a bio-basedsuccinate industry . Appl Mierobiol Bioteehnol ， 2007(76) : 727 3 詹晓北，朱一晖，Donghai Wang .琥珀酸发酵生产工艺及其产品市 场. 食品科

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