SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

1、1 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质分子量定蛋白质分子量 2 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物 生物化学实验技术教学中一个重要实验之生物化学实验技术教学中一个重要实验之 一。一。 3 能够带动生化实验技术综合型能够带动生化实验技术综合型 实验项目的开设。实验项目的开设。 如：蛋白质盐析沉淀提取如：蛋白质盐析沉淀提取 葡聚葡聚 糖凝胶层析分离糖凝胶层析分离 DEAE-纤维素分离纤维素分离 提纯蛋白质提纯蛋白质 蛋白质纯度鉴定、蛋白蛋白质纯度鉴定、蛋白 质分子量测定等。质分子量测定等。 4 一、实验目的一、实验目的 n通过该实验使学

2、生掌握通过该实验使学生掌握SDS-PAGESDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理；测定蛋白质分子量的原理； n掌握该技术的操作方法（基础性很掌握该技术的操作方法（基础性很 强，使用范围宽阔强，使用范围宽阔； n运用运用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 及染色鉴定。及染色鉴定。 5 二、实验原理二、实验原理 n带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动， 这种现象称为这种现象称为电泳。电泳。 n电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。 n区带电泳区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄

3、是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。持介质中迁移。 6 区带电泳使用不同的支持介质，有区带电泳使用不同的支持介质，有 滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用现在则多用聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）和和 琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶。 7 （一）分类（一）分类 PAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为根据其有无浓缩效应，分为 连续系统和不连续系统连续系统和不连续系统两大类：两大类：

4、1. 1. 连续系统：连续系统：电泳体系中缓冲电泳体系中缓冲 液液pHpH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在值及凝胶浓度相同，带电颗粒在 电场作用下，电场作用下，主要靠电荷和分子筛效主要靠电荷和分子筛效 应。应。 8 2. 2.不连续系统不连续系统：由于缓冲液离子：由于缓冲液离子 成分、成分、pHpH、凝胶浓度及电位梯度的、凝胶浓度及电位梯度的 不连续性，带电颗粒在不连续性，带电颗粒在电场中泳动电场中泳动 不仅有电荷效应，分子筛效应，不仅有电荷效应，分子筛效应，还还 具有浓缩效应，具有浓缩效应，因而其分离条带清因而其分离条带清 晰度及分辨率均较前者佳。晰度及分辨率均较前者佳。 9 （二）特点：（二）

5、特点： SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDSSDS（十二（十二 烷基磺酸钠）。烷基磺酸钠）。 10 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的的SDSSDS溶液中，与溶液中，与SDSSDS分子按比例结合，分子按比例结合， 形成带负电荷的形成带负电荷的SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。 蛋白质丧失了原有的蛋白质丧失了原有的电荷状态电荷状态形成形成 仅保持原有分子大小仅保持原有分子大小为特征的负离子团为特征的负离子团 块，块，降低或消除了各种蛋白质分子之间降低或消除了各种蛋白质分子之间

6、 天然的电荷差异天然的电荷差异，因此在进行电泳时，因此在进行电泳时， 11 蛋白质分蛋白质分子移速度取决于分子大小。子移速度取决于分子大小。 当分子量在当分子量在15000KD15000KD到到200000KD200000KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的之间时，蛋白质的迁移率和分子量的 对数对数呈线性关系呈线性关系。合下式：合下式： ，式中，式中 将已知分子量的将已知分子量的标准蛋白质的迁标准蛋白质的迁 移率对分子量对数作图移率对分子量对数作图，可获得一条，可获得一条 标准曲线标准曲线，未知蛋白质在相同条件下，未知蛋白质在相同条件下 进行电泳，根据它的电泳迁移率即可进行电泳，根据它的电泳

7、迁移率即可 在标准曲线上求得分子量。在标准曲线上求得分子量。 12 图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与logMW之间的关系 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 胶槽胶槽1 23 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白 得到同行专家赞 13 采用采用SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测蛋白质分子量时，必须法测蛋白质分子量时，必须完全打开完全打开 蛋白质之间的二硫键，使蛋白质分子蛋白质之间的二硫键，使蛋白质分子 被解聚，被解聚，SDSSDS才能定量地结合到亚基才能定量地结合到亚基 上。上。因此在用因此在用

8、SDSSDS处理样品同时用处理样品同时用巯巯 基乙醇处理基乙醇处理。巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从 而使很多不溶性蛋白质溶解而与而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDSSDS定量结合。定量结合。 14 三、三、 实验试剂和器材实验试剂和器材 材料材料 实验试剂实验试剂 1.低分子量标准蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100

9、鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于开封后溶于200l蒸馏水，置蒸馏水，置-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。分钟后上样。 样品样品1：称：称3mg样品样品1，加，加2 ml蒸馏水溶解蒸馏水溶解。 15 2. 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）：称）：称Acr30g， 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml，过滤，过滤 后置棕色瓶中后置棕色瓶中 3. 10%SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠） 4. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称缓冲液：称 取

10、取Tris18.2g（PH计）计） 16 （7）10%过硫酸铵过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（巯基乙醇（0.1ml） + 溴酚蓝（溴酚蓝（2mg）+甘油（甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至），最后定容至10ml。 （10）固定液：取）固定液：取50%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混匀。混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固，加上述固 定液定液 250ml， 过滤后备用。过滤后备

11、用。 （12）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸馏水定容，加蒸馏水定容 至至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液pH8.3）：称）：称Tris6.0g，甘，甘 氨酸氨酸 28.8g，加入，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。 17 实验器材实验器材 n 垂直板电泳装置垂直板电泳装置 n直流稳压电源电泳厚胶浓度后要做直流稳压电源电泳厚胶浓度后要做8各小时，薄胶各小时，薄胶5各小时）各小时） n 电泳仪电泳仪 n

12、标准型酸度计（标准型酸度计（TLD80-2B） n 离心机等离心机等 18 四、四、实验过程实验过程 如：如：免疫球蛋白免疫球蛋白G G 分子量的测定分子量的测定 （一）血清（一）血清- -球蛋白的提取球蛋白的提取 硫酸胺盐析沉淀法硫酸胺盐析沉淀法 （二）（二） - -球蛋白球蛋白脱盐脱盐纯化纯化 葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到- - 球蛋白球蛋白（去年完成的基金项目）（去年完成的基金项目） （三）纯化免疫球蛋白（三）纯化免疫球蛋白G G DEAE-DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G G。 （四）（四）

13、 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定血液免疫球血液免疫球 蛋白蛋白G G的分子量的分子量（ 连续四个单项实验）。 19 （1 1）制胶）制胶（简单叙述（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）（双层胶，摸索胶浓度） A.A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , 准备准备2 2个干个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。 B.B.按比例配好按比例配好分离胶，分离胶，溶液立即倾入制胶溶液立即倾入制胶 模板中模板中(1 5(1 5模板模板) )，加少许蒸馏水，待胶凝，加少许蒸馏水，待胶凝 固后，倒出水并用滤纸把剩余

14、的水分吸干，按比固后，倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比 例例配好浓缩胶，配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘 5mm5mm处，样梳需一次平稳插入，静置处，样梳需一次平稳插入，静置4040分钟，待分钟，待 模板中的胶定型后，轻轻取出梳形样品槽模具，模板中的胶定型后，轻轻取出梳形样品槽模具， 梳口处不得有气泡，拔出样梳后，在上槽内加入梳口处不得有气泡，拔出样梳后，在上槽内加入 缓冲液。缓冲液。 20 C.C.拔出样梳后拔出样梳后, ,在上槽内加入缓冲液在上槽内加入缓冲液, , D. D.加样（摸索加样量）加样（摸索加样量） 取取10l标准蛋白标准蛋白溶解液于溶解液于

15、 EP管内，再加入管内，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为20l。 取取10l样品溶液样品溶液，再加入，再加入10l 2倍样品缓冲液，上倍样品缓冲液，上 样量分别为样量分别为5l 和和10l。 E.E.用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样, ,加样前加样前, , 样品在沸水中样品在沸水中加热加热3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。 21 F.F.电泳槽中加入缓冲液，电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行接通电源，进行 电泳，开始电流恒定在电泳，开始电流恒定在8mA，（电流、电压），（电流、电压） 当进入分离胶后改为当进入分离胶后改

16、为16mA，溴酚蓝距凝胶边，溴酚蓝距凝胶边 缘约缘约5mm时，停止电泳。时，停止电泳。 G.G.凝胶板剥离与染色凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开电泳结束后，撬开 玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内， 加入染色液，染色加入染色液，染色 过夜。过夜。 H.H.脱色脱色 染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数 次，再用脱色液脱色次，再用脱色液脱色 。 剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保持胶完好无损, ,染色要充分染色要充分。 22 图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与logMW之间的关系 五、实验结果分

17、析五、实验结果分析 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 胶槽胶槽1 23 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白 23 六、分析计算六、分析计算 绘制标准曲线绘制标准曲线：按下式计算 电泳迁移率电泳迁移率 = 样品迁移距离样品迁移距离/溴酚篮迁移距离溴酚篮迁移距离 以每个以每个蛋白标准的分子量对数蛋白标准的分子量对数对它的相对对它的相对迁移迁移 率作图率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可 测出其分于量，这样的标难曲线只对测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶同一块凝胶 上的样品的分子量测定才具有可

18、靠性。上的样品的分子量测定才具有可靠性。 24 标准蛋白分子量（标准试剂盒）：标准蛋白分子量（标准试剂盒）： 97400kD、66200kD、43000kD、 31000kD、20100kD、14400kD。 采用不连续采用不连续SDS-PAGE电泳法对所分电泳法对所分 离纯化的蛋白质进行纯度鉴定，发现图中离纯化的蛋白质进行纯度鉴定，发现图中 电泳图谱可以清晰的看到电泳图谱可以清晰的看到两条蛋白带两条蛋白带。 25 两条蛋白带代表两条蛋白带代表绵羊免疫球蛋白绵羊免疫球蛋白G的重的重 链和轻链。链和轻链。 计算分析结果表明：计算分析结果表明： 绵羊血清绵羊血清lgG重链和轻链的分子量分别重链和轻

19、链的分子量分别 为为50000和和28000Kd。一般说来，当蛋。一般说来，当蛋 白质的分子量在白质的分子量在200000至至15000 kD 之之 间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性 关系关系 。实验结果各谱带所代表的成分的分实验结果各谱带所代表的成分的分 子量的范围均在此之间。子量的范围均在此之间。用用SDS-PAGE垂直板电泳测得绵羊血清具有一垂直板电泳测得绵羊血清具有一 定的可信度定的可信度 。 26 七、思考题七、思考题 n在不连续体系在不连续体系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,当分离胶加完后当分离胶加完后, ,需需 在其上加一层水在其

20、上加一层水, ,为什么为什么? ? n在不连续体系在不连续体系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,分离胶与浓缩胶中分离胶与浓缩胶中 均含有均含有TEMEDTEMED和和AP,AP,试述其作用试述其作用? ? n样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟? ? 27 十二、达到预期目标十二、达到预期目标 1. SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动是动 物生物化学实验技术教学中物生物化学实验技术教学中一个综合性实一个综合性实 验项目验项目， 且是一个较高水平的一个实验项且是一个较高水平的一个实验项 目。目。 28 蛋白质盐析沉淀提取蛋白质盐析沉淀提取 凝胶层析分离（上年基金项目已完成）凝胶层析