动物细胞工程.pdf概要

1、动物细胞工程Animal Cell Engineering一 动物细胞工程基本概念： 原理和方法：细胞生物学,分子生物学及工程 学原理 对象：动物细胞 设计改造：动物细胞遗传性 目标：创造新物种，提供名贵药品及服务二 动物细胞工程研究主要内容 ： 动物细胞培养技术 细胞融合技术 单克隆抗体技术（即杂交瘤技术） 动物细胞大规模培养技术 基因及细胞器染色体的改造与转移，核移植技术; 克隆技术 细胞反应动力学 动物细胞反应器 胚胎工程技术:试管婴儿胚胎移植、胚胎分割、胚 胎发育，胚胎干细胞技术应用于生物高技术产业:有价值的细胞产品:疫苗,抗体,酶和生长因子等。 细胞培养系统:毒品和药物检测 细胞治疗

2、 基因治疗 组织工程转基因动物及克隆动物国内单克隆抗体药物为鼠源型或人鼠嵌合型，人源 性抗体还处于研究的起步阶段东莞宏远逸士生物技术药业国家一类新药 “恩博克乳膏”（抗人白细胞介素-8 单克隆抗体）-牛皮癣第四军医大学基础部 国家一类新药 肝癌单抗放免诊断剂和治疗剂-原发性肝癌的体内定向诊断及体内导向治疗第一节 动物细胞培养特性及一般培养技术一 动物细胞培养的概念从动物体内取出细胞或组织，用物化方法使 其分散成游离细胞，在模拟体内生理环境的体外 条件下进行培养，使之生长繁殖的过程。二 动物细胞培养特性1 锚地依赖性（贴壁依赖性）:大多数动物细胞只能附着或贴在固体或半固体表 面上培养才能生长 例

3、外：肿瘤细胞 ，血液，淋巴细胞Vol 465/27 May 2010 Nature 成纤维细胞型 上皮细胞型 游走细胞型 多形细胞型2 接触抑制性 :当细胞长满于附着物表面， 相邻细胞表面间相互接触， 使细胞对数生长期停止进入稳定期，细胞生长大大减慢，细胞生长，死亡 处于动态平衡。3 群体效应：-单个细胞难生长，聚集成团易生长4 原代培养(Primary Culture)：（初代培养，初始培养）定义:直接从机体取材（细胞，组织或器官）并置于 体外条件下生长到第一次移植继代培养。原代培养细胞特点）一定程度上反映体内状态；）具二倍体遗传性状（至少细胞与来源动物 的细胞核型（数目形态）相同）；）生物

4、性状未发生很大变化； ）用于研究基因表达，药物测试； ）由多种细胞组成5 移植继代培养（传代培养）：移植继代培养号: 初代、二代、三代-N代细胞培养6 细胞系和确立细胞系建立： 细胞系(cell line)-原代培养经第一次移植继 代培养成功后，形成的多种细胞群体为细胞 系。 确立细胞系可永久性移植继代培养， 细胞形态，染色体结构发生变化，不具有群 体效应、锚地依赖性、接触抑制性，丧失组 织分化能力和脏器特异性，可悬浮培养。 有限细胞系、无限细胞系7 细胞株和确立细胞株建立：细胞株(cell strain)从原代培养物或细胞系，通 过筛选或克隆培养，获得的具特殊性质或特殊标志 的单一类型细胞群

5、体（如特殊抗原性，抗病毒性）确立细胞株可永久性移植继代培养的细胞株， 细胞形态，染色体结构发生变化。不具群体效应、 锚地依赖性、接触抑制性，丧失组织分化能力和脏 器特异性，可悬浮培养。建立细胞株（系）的要求美国ATCC细胞库的入库标准 1）组织起源和已经传 7）细胞形态代的代数 8）核型 2）冻存液 9）无菌检测：细菌、真 3）细胞活力菌等 4）培养液：培养基、 10）物种检测：检测同 血清和抗生素 5）融解后细胞生长特工酶谱 11）反转录酶检测性 6）接种存活率 12）细胞建立者 13）检测者三 动物细胞培养液及配制1 营养需求:培养液的组成成分 氨基酸：氮源, 盐类：钠，钾，镁，钙，氯，硫

6、酸根，磷酸根， 碳酸氢根离子等 葡萄糖：碳源, 供能 缓冲系统：CO2缓冲系统或HEPES 生长因子：EGF等 其它成分：维生素(辅酶)，矿物微量元素，有 机补充物，激素生长因子，嘌呤，嘧啶，谷胱 甘肽等2 平衡盐溶液（BSS） 功效： 维持渗透压 提供缓冲系统调 节pH 提供水分和无机 盐. 配培养基和洗材 料用.3 培养基类型 天然培养基 生长贴壁好 基本合成培养基(基础培养基) DMEM 完全培养基 无血清培养基基本合成培养基补充因子 补充因子: 必需因子-细胞生长因子与激素特殊因子-贴壁因子(纤粘连因子,层粘连因子) 蛋白酶抑制剂4 其它常用液 消化液：胰蛋白酶、EDTA、 胶原酶 调

7、节pH值: HEPES缓冲剂，NaHCO3溶液四 动物细胞培养实验条件 实验室 准备间 缓冲间 培养室五 动物细胞一般培养技术动物细胞培养方式1 组织块培养法2 细胞单层培养法3 细胞克隆培养1. 组织块培养法概念- 动物组织切成直径12mm立方小块 进行培养的方法。特点1)原代培养法2)适宜于消化分散困难的材料如皮肤细胞3)获得混合细胞群体培养过程 组织块 漂洗剪切 瓶底 翻转培养瓶 组织块粘附 再翻转瓶组织块周围长出 新细胞单层2. 细胞单层培养法概念-动物组织块经消化分散成单个细胞或 细胞团块后，粘附于培养容器表面培养成新 生细胞单层的培养法.特点 1)用单个细胞悬液或细胞团块2)原代培

8、养法或移植继代培养贴壁生长细胞传代培养 80%或接近成片 吸弃培养基 胰蛋白酶0.25%+EDTA0.02%消化 加培养基终止消化 收集，离心 计数 接种，一般 27106细胞/ml的浓度传代培养(移植继代培养)3 单细胞分离培养(细胞克隆培养)定义：即把一个单细胞从一个群体中分离出来 单独培养，使之重新繁衍成为一个新的细胞 群体的培养技术。 获得纯系-细胞株。 特点 须条件培养基 须饲养细胞(释放特异生长因子) 尽可能减少浸浴细胞的培养基量饲养细胞(滋养细胞)定义：在细胞培养中，加入的活细胞(如小鼠 胸腺细胞或腹腔细胞)能促进单个或少数分 散细胞的生长增殖，其本身无分裂能力，克 隆形成后，自

9、身死亡。克隆培养要求:细胞悬液浓度-10个/ml以下 接种浓度-0.1ml悬液，使每孔的细胞数平均为1个培养基：最好使用适应性培养基-(丌含细胞而被细 胞生活过)约培养24h更换新液,每培养48天换液一次，直至形 成单克隆.移植继代培养-培养8一10天，除生长液-无Ca2+、Mg2+平衡盐洗-胰蛋白酶消化-0.2ml生长液分散-每孔细胞移至25cm2表面培养瓶-加3ml生长液培养3天-除一半生长液，再加等体积新生长液-几天后长成多个成片新克隆细胞.细胞克隆培养优点:1)简便易行, 可靠性不重复性好2)分离混杂细胞的优良方法，3)饲养细胞可用1-10U胰岛素代替4)可用于建立纯细胞系，检查细胞遗

10、传性的一致性， 分离细胞变种，评价药物及毒物对细胞生长的影响， 筛选淋巴细胞杂交瘤及基因工程细胞，制备单克隆 抗体.六动物细胞种质保存及其运输超低温冰冻法 特点: 1)保护剂，常用的保护剂有 二甲亚砜DMSO,浓度5-12.5% 甘油 5%-20%保护剂机理：结合水分子，降低组织结冰速 度，提高膜透性2)保存过程:冻存过程3)动物细胞种质复苏 ： 融化 DMSO浓度应降至1以下 贴壁培养第二节 动物细胞融合技术一 动物细胞融合技术概念在外力作用下，两个或两个以上异源动物 细胞合并为一个多核细胞，同时表达两者或两 者以上细胞有益性状的过程，称为动物细胞融 合技术继续培养后,多核细胞核融合成为单核

11、融合 细胞(杂种细胞), 亦称为动物体细胞杂交技术 同种细胞的融合称为同核体 不同种细胞的融合称为异核体 杂种细胞杂种细胞系1促融因素(促融剂，融合剂）概念: 能使细胞膜发生变化，两个或多个细 胞发生融合的特殊诱导物质或外力。2 促融剂作用机理作用于细胞膜融合基础：膜蛋白-重新分布 融合关键：脂质双分子层-相互作用及重新排布3 促融剂种类 . 生物促融剂：病毒 . 化学促融剂：PEG . 物理促融剂：电场力聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 优点： 融合成本低，勿需特殊设备 融合子产生的异核率较高 不受物种限制 缺点： 融合过程繁琐 PEG对细胞有毒害物理促融剂-电场力，离心力，激光电诱导融合技

12、术：）概念在一定条件下，通过瞬时高强 度电脉冲作用使细胞成珠串状，膜粘连，膜 蛋白及膜脂分子重新排布，细胞融合.）作用特点 可人为控制，融合率高 5080;结合显微操作可定向诱导Review动物细胞培养 动物细胞培养概念 动物细胞培养特性：贴壁依赖性、接触抑 制性、群体效应、密度抑制性。 动物细胞培养技术：原代培养、传代培养 （细胞系与细胞株） 细胞培养液 细胞培养技术：组织块培养、细胞单层培 养、细胞克隆培养（饲养细胞）。 细胞冻存与复苏：慢冻速复动物细胞融合 动物细胞融合技术 动物细胞杂交技术 促融剂三 细胞融合及遗传物质转移方式 完整细胞之间的融合 核体、胞质体与完整细胞的融合 微细胞与

13、完整细胞的融合 脂质体介导的细胞融合A Lipo2000+GFPLipo2000+siRNAB Lipo RNAi MAX+GFPLipo RNAi MAX+siRNACo-transfection: Lipofectamine 2000CGFPsiRNAwhite lightmergeCo-transfection: Lipofectamine RNAi MAXDGFPsiRNAwhite lightmerge二 杂种细胞筛选原理及筛选系统筛选原理 依据细胞生理生化特性-设计特定筛选系 统-选择性培养基上-终止同型多核、 异型多核及未融合亲本细胞的繁殖-仅 允许异型双核细胞繁殖(或探针筛选)

14、。 异型双核融合子-核融合=杂种细胞(具有 生长和繁殖力)。筛选系统 种类 HAT选择系统 抗药性筛选系统 营养互补筛选系统 原位杂交法 基因探针选择法等。HAT选择系统 (生物化学选择法)1) HAT: 含一定浓度次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、及胸腺 嘧啶核苷(T)的一种选择性培养基。2) 2条DNA合成的途径： HGPRT细胞:嘌呤核苷酸; TK细胞:嘧啶核苷酸; 有全合成途径合成。 A (二氢叶酸还原酶抑制剂)，抑制嘌呤或嘧啶核苷 酸全合成途径。3) 淋巴细胞杂交瘤生产McAb依据 一亲本细胞: 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT）或 胸腺嘧啶核苷激 酶缺陷型（TK）骨髓瘤

15、细胞 +另一亲本:具有合成DNA的两条途径不能 在体外长期分裂繁殖的淋巴细胞 = 融合的杂种细胞，可通过补救途径合成DNA，存活。淋巴细胞杂交瘤技术的基本过程1选择制备 亲本细胞2细胞融合3筛选及 克隆化培养4大量生产5分离纯化三 细胞融合技术应用1. 染色体的基因定位2. 遗传疾病的治疗不基因互补分析 依据: 基因互补作用,互补分析3. 临床医学不药物 单克隆抗体(鉴定细菌种型 检测极小肿瘤 病灶，心肌梗死部位 检测排卵期 单抗 携药物=“生物导弹”) 生长激素促性腺激素4. 繁育优良品种高产奶牛、瘦肉型猪等第一代单克隆抗体治疗剂-近年热点缺陷：1 鼠源：有人抗鼠抗体反应 (HAMA反应)2

16、 半衰期短, 56小时3 生物活性不理想4 完整Ig分子量大,难以穿透肿瘤组织,达不到有 效剂量第三节 动物细胞 大规模培养技术一. 概念人工条件下，高密度大量培养基因工程、细 胞融合或转化所形成的有用动物细胞，生产珍贵 药品的技术，为细胞工程不可缺少的一部分。培养基-与实验室基本一致，常采用无血清培养基二 . 培养技术种类:1.悬浮培养法-适于肿瘤细胞、杂交瘤细胞、血 液及淋巴细胞.2.固定化培养法- - -适于正常组织细胞、二倍体细胞.3.微载体培养法- - -由上述二法发展而来，具有悬浮培养固定化培养优点，适于正常组织细胞、二倍体 细胞.一 悬浮培养法 1. 概念- - -细胞在培养液中

17、呈悬浮状态生长繁殖 的培养方法 2 .特点 : 1)适于培养肿瘤细胞、杂交瘤细胞、血液细胞、 淋巴细胞 2) 可连续测定细胞浓度，连续收集部分细胞进行 移殖继代培养 3) 移殖继代无需消化分散，免受伤害 4) 细胞收率高二 固定化培养法 1 .概念 -将细胞限制或固定在特定空间位置的 培养技术. 2 .优点 : 1)细胞生长密度高， 2)细胞损伤低， 3)易更换培养液; 4)易分离细胞和培养液， 5)产物浓度高，易分离纯化 3 方法 : 1)吸附法- -中空纤维膜，陶瓷，硅胶 2)包埋法 - -琼脂，琼脂糖，胶原三 微载体培养法 1概念-将细胞吸附于微载体表面，在培养液 中进行悬浮培养，使细胞

18、在微载体表面长成单层 的培养方法. 葡聚糖等聚合物组成 2 优点 : 1)比表面积大 2)细胞生长均一 3)占用空间小，培养基利用率高 4)重复性好 5)易收获，易检测三 大规模动物细胞培养的问题及对策1.细胞培养环境中抑制因素的积聚1)氨离子的积累:防止方法:防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量.2)高浓度乳酸 :防止方法: 降低培养基葡萄糖浓度;平衡葡萄糖 和Gln的比例.3) CO2积聚 :防止方法: 控制通气参数，平衡氧输送及CO2 去除2 细胞死亡与凋亡凋亡最终执行者 Caspase家族(半胱氨酸蛋白酶)1)营养物质抗凋亡2) 将bcl-2基因-最有效细胞凋亡抑制基因导入细胞中

19、3 培养基与细胞系 1.无血清培养基 避免血清的批次、质量、 污染、成分等。 2 .不同类型的细胞有各自的无血清培养基构 成。4 对生物反应器 培养状态参数 在线过程监控 温度、pH值发酵罐 溶解氧的浓度监测 在线蛋白含量测定 产品的一致性转基因动物及其在医药行业中的应用1980年,耶鲁大学弗兰克鲁德(Frank Ruddle)教授首先使用 了“转基因”这个术语，并在其实验室率先把一段人病毒基因植 入小鼠中-创造出转基因小鼠.1982年转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的 二倍-“超级小鼠”。兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动物的成功。1987年Gordon等人在转

20、基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维 蛋白溶酶原激活因子（tPA),用于治疗人类相关疾病。“转基因动物”（transgenic animal）1983年，世界上第一例转基因 植物一种含有抗生素药 类抗体的烟草在美国成功培植惊叹：“人类开始有了一双创造新生物的上帝之手。” “转基因”-关注的焦点20年来，转基因作物种植面积迅速扩大. 1996年，世界转基因作物种植总面积仅为170万公顷， 2002年全球转基因农作物种植 面积扩大到5870万公顷。1993年，世界上第一种转基 因食品转基因耐存储晚 熟西红柿正式投放美国市场。一. 转基因技术 和转基因动物 基本概念： 应用基因重组和胚胎工程原理, 将某种

21、外源基因在 体外扩增和加工 , 再导入到受精卵或胚胎里，与染色体DNA稳定地整合在一起,能稳定地遗传，在体 内稳定地表达;当胚胎被移植到代孕动物的子宫后， 发育成转基因动物。 染色体基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗 传的一类动物 .转基因技术带来革命转基因技术是代表未来的生物技术之一 基因组和蛋白质组研究相关技术 计算机药物设计 转基因技术/基因治疗技术 器官克隆技术 干细胞技术 微型机器技术 半导体与脑神经的通讯技术21世纪生物科技将全方位 地改变世界IT只改变人的生活模式生物科技则改变人本身将改变物种演化的规律为什么很多国家反对转基因技术? 宗教因素 公众缺乏对现代科学技术的理解19

22、98年11月，孟山都公司在印度的两块试验 地被当地人焚烧，原因是该公司在转基因植物中 采用了“雄性不育”技术。一些农民怀疑这些 “雄性不育” 的植物与人接触后也会使人患上 “不育症”。瑞典的一个民意测验结果表明，60的人认 为普通食物中没有基因。 生态学家们出于生态平衡的考虑 对未知的彷徨 贸易壁垒的需要对人体有害的转基因食物？可以制作出来，但是要别有用心。比如 转入一些基因来合成有毒的生物碱，合成 河豚毒素,等等。 人体对付有毒物质有两道防线：肠道的选择性吸收；肝脏解毒。要通过这 两道封锁线不容易。转基因作物潜在危害 转基因/抗性基因的不良传播； 对生态系统的影响（蝴蝶事件）； 对生物多样性

23、的潜在影响； 对遗传稳定性的担心； 对世界农业格局的冲击（种子垄断）； 新生过敏原“马铃薯事件”和 “BT基因玉米事件” 英国一位研究人员：用含有转基因的马铃薯 饲养大鼠，引起了大鼠器官生长异常、体重 减轻、免疫系统遭到破坏. 英（自然）刊登了美国康奈尔大学副教授约 翰罗西的一篇论文说，把抗虫害转基因玉米BT基因玉米的花粉撒在苦苣菜叶上， 然后让蝴蝶幼虫啃食这些菜叶。4天之后， 有44%的幼虫死亡。有必要规范转基因生物的安全性 1993年国家科委基因工程安全管理办法 1996年农业部农业生物基因工程安全管理实 施办法 1997年农业部关于贯彻执行农业生物基因工 程安全管理实施办法的通知 199

24、7农业部成立农业生物基因工程安全委员 会和农业生物基因工程安全管理办公室 2001国务院农业转基因生物安全管理条例二.培育转基因动物 基本步骤： 目的基因选择制备 外源目的基因的有 效导入 整合外源基因受精 卵/胚胎的检测、筛选, 与移植入受体动物， 对出生后基因整合、 表达情况进行检测.外源基因导入的时机三. 转基因动物的基因导入方法 ： （）DNA显微注射 （）胚胎干细胞技术 （）逆转录病毒介导的基因转移 （）精子作为载体 （）核转移技术（克隆）(一)、DNA显微注射技术导入受精卵的原核内 2003 John Wiley and Sons Publishers1.整合率低(小鼠1% )，其

25、他动物成功率更低，成本高。 2.丌能定点整合，具有随机性。1980 PNAS 77,7380-7384(二)、胚胎干细胞技术基因打靶:基因打靶载体上目的基因两侧带有不受体动物染色体 特定位点的同源序列，通过同源重组将靶基因定点整 合到ES细胞的染色体上的过程.定点整合,实验周期长,只局限于小鼠干细胞 Stem cell定义：一类具有自我更新和分化潜能的细胞。包括: 成体干细胞-成年动物组织和器官中具有修复和再 生能力的细胞. 造血,神经干细胞.胚胎干细胞-Embryonic Stem cell( ES细胞)，当受精卵分裂成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干 细胞。能分化为体内所有组织的能力。利

26、用胚胎干细胞技术外源基因转入ES细胞，再接种到胚胎中,产生转基因嵌合小鼠.(1993) Nature 365, 8789(三)、逆转录病毒介导的基因转染1.整合率高，成本低，2. 逆转录病毒有致癌性；3. 外源基因小于10Kb；4.影响外源基因的表达。(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 6148 6152(四)、精子介导法 外源DNA+精子 孵育， 精子捕获外源DNA，通过受精将外源DNA 导入受精卵。(五) 、核移植技术优点： 转基因效率显著超过显微注射 可以使用定点整合目标基因的技术显微法和克隆法效率比较方法处理胚胎数移植数生产牛犊数转基因

27、牛数显微注射115411541292克隆法27633331997 Nature 385, 810813四. 转基因动物在医药业的应用： 研究基因的结构功能及其表达调控 创建人类疾病实验模型 医用器官移植的供体 改良动物品种 药物产品生产 生物反应器 -乳腺生物反 应器 -“生物药厂”乳腺生物反应器 国家“863”计划” “国家高技术研究不发展计划”6000美元1磅的羊奶! 身价30万美元的羊!每年产奶价值数十亿美元奶牛!美国每年血友病人-600万人输血-2头牛细胞培养生产1克药物蛋白质，成本800-5000美元， 转基因动物 0.02-0.5美元。一种新药从研发、药审、到上市, 需15-20年

28、。 转基因动物-乳腺生物反应器，5年左右。转基因克隆动物制备 乳腺生物反应器 将药用蛋白基因导入体细胞内,再以携带目的基 因的体细胞为核供体,进行动物克隆。1.-乳球蛋白启动子下游+组织纤溶酶原激活剂tpA基 因;2.转基因技术, 整合到乳腺细胞基因组3.核移植技术4.繁殖,筛选 只在乳腺中表达，乳汁中含高浓度tpA 蛋白。克隆动物与转基因动物 动物克隆和转基因动物技术不同， 动物克隆技术是核移植的一种无 性繁殖法.细胞核移植技术定义： 将一个动物的细胞核 移植入去核的未受精卵母细胞中，并发育生长,产生遗传上同质性状 的克隆动物的技术(即无性繁殖)如羊乳腺细胞和另一只动物的去核卵细胞 （如羊卵

29、细胞）进行细胞融合,使发育成动物的 克隆。clone sheep Dolly克隆羊培育过程体细胞 提取核乳腺电脉冲刺激回植重组细胞Dolly去核胞质体胚胎卵细胞妊娠、出生细胞核移植多子宫利目前奶汁中生产人类蛋白质药物：牛奶：抗凝血酶、人白血清蛋白、生育激素、乳缺蛋 白、糖基转移酶等；山羊奶：抗凝血酶原、 -抗胰蛋白酶( -AT)、生育激 素、组织纤溶酶原激活剂（tPA）； 绵羊奶：抗胰蛋白酶、凝血因子IX、蛋白质C； 猪奶：蛋白质C、凝血因子IX、纤维蛋白原、血红蛋白。目前奶汁中生产人类蛋白质药物：动物多肽药物用途绵羊a1抗胰蛋白酶蛋白治疗气肿绵羊CFTR治疗囊肿性纤维化绵羊组织型纤溶酶原活化

30、因子治疗血栓绵羊凝血VIII因子、IX因子治疗血友病绵羊纤维蛋白原伤口愈合猪组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓猪凝血VIII因子、IX因子治疗血友病山羊人蛋白质 C治疗血栓山羊抗血栓因子 3治疗血栓山羊谷氨酸脱羧酶治疗I型糖尿病山羊Pro542治疗爱滋病牛a-乳清白蛋白抗炎症牛凝血VIII因子治疗血友病牛纤维蛋白原伤口愈合牛胶原蛋白 I, II组织修复, 治疗风湿性关节炎牛乳铁蛋白治疗肠道感染, 感染性关节炎牛人血清白蛋白维护血液体积1997年年底，英国爱丁堡制药公司 培育出200头携带人体基因的绵羊， 奶汁中- 1抗胰蛋白酶。泌乳期的每只羊可产70g，价值达70万美元 .欧美等国在转基因动物方面

31、开发了至少120种以上 的药物 ，2种药物完成临床试验，5种进入临床三 期，37种进入二期临床研究。国际上有13家公司开发乳腺生物反应器五. 尚待解决的问题： 成功率低,成活率低。 目的基因定点整合,遗传表型不能遗传给后代 及不能表达或表达混乱问题. 产品纯化问题 安全性问题。六.前景： 21世纪生物医药产业新的药物生产模式。 美国红十字会：到2010年，转基因动物生 产的商品达500亿美元销售额，生产的药物 占整个基因工程药物的90%以上。基因治疗（genetherapy）一.基因治疗 基本概念：向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，纠正或 补偿其基因缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，表 达新产

32、物达到治疗目的 常用：造血细胞 肝细胞 淋巴细胞 肌肉细胞二. 理想的基因治疗：1.外源基因可有效导入靶细胞2.在靶细胞中长期稳定存留3.能适量表达4.导入基因方法及载体对宿主细胞安全无害三. 基因治疗的方法：1.生物学方法逆转录病毒载体，腺病毒载体，重组病毒2.非生物学方法脂质体，电穿孔法, 显微注射法, 基因枪法等感染细胞反义核酸 基因治疗反义技术：用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，使编码蛋白的gene不能转录为mRNA 或阻断翻译相应蛋白.四. 基因治疗基本方式： 1.体内直接转基因体内法in vivo缺点:DNA不易进入细胞，易被降解，易引起免疫 反应。2. 体细胞介导的基因治

33、疗回体法（间接体内） ex vivo五. 基因治疗的应用研究：1990.9.14首例基因治疗免疫缺陷症4岁 女孩 缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)严重破坏免疫功能ADA-Gene + vector （逆转录病毒）重组分子导入患者淋巴细胞细胞生长分裂10天Gene表达回输患儿体内12月治疗一次10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%六 基因治疗的策略 基因置换 基因修复 基因修饰 基因失活 “自杀”基因 其他自杀基因(编码某种酶的基因) 的基因治疗自杀基因 + 病毒载体转染重组载体药物前体 无毒Gene酶药物复合物有毒细胞死亡七. 基因治疗 主要问题载体不理想转移基因不表达表达时间和表达量不确定 基

34、因治疗的对象: 许多疾病都是多 基因疾病。八. 基因治疗的前景 1990来，近20个国家。 至1999，注册的基因治疗方案396个， 受试者近3278个。 已在肿瘤、艾滋病、胆固醇疾病、血友病、肝病、遗传性神经疾病等方面有了疗效。基因治疗遗传性疾病干细胞 (stem cell)2001 年末 ,science把干细胞研究列为2002年六大热门科技领域榜首,胚胎干细胞成体干细胞或组织干细胞1 胚胎干细胞胚胎发育早期阶段的每个卵裂球和胚胎发育至 囊胚期,这些未分化的具有全能或多能性的胚胎细胞，能分化为各种类型体细胞称为胚胎干细胞,，细胞 -万能细胞(embryonic stem cells),是细

35、胞工程的重要材料分离纯化方式：流式细胞仪、磁珠表达等人胚胎干细胞的来源 人工授精中捐献的多余胚胎中获取 死亡胎儿尸体的原始生殖组织中分离 体细胞核转移技术所创造的胚胎中分离成体干细胞或组织干细胞 血液、皮肤、消化道上皮和肝脏等组织的干细胞。 小肠和皮肤的干细胞也分别只具有分化、 补充与更新小肠和皮肤组织的能力； 造血干细胞和骨髓间质干细胞分别在脑组织环境中能分化出神经细胞。 在一定的微环境仍具有很强的可塑性,可分 化为该组织谱系外其它类型细胞。2 国内外研究现状和发展趋势三个发展阶段: 1960-1980年为第一阶段 用小鼠早期胚胎移植至同系小鼠体内, 可发展为畸胎瘤,从其中分离胚胎癌细 胞的

36、干细胞：具有发育多能性,可分化 为神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞和上 皮细胞等； 1980-1998年底,威斯康星大学汤姆森研究 组成功建立人类细胞-蓬勃发展的第 二阶段。 建立了各种动物包括牛、羊等家畜细胞 系,在分离培养各种动物细胞条件、小 鼠细胞定向诱导分化和基因操作等方面 积累有用资料。 20世纪末,克隆羊多利问世 人类细胞培养建系成功 组织干细胞超越胚层分化潜能，开创了“干 细胞工程学”研究： 第三阶段-特点是将“克隆”技术和“干 细胞”研究两者融为一体。 最近,上海第二医科大学所属实验室将 干细胞研究+组织工程技术,在骨、软 骨、肌腱和神经细胞等方面取得高水 平的成果 将细胞定向诱导分化成特定类型 细胞用于临床治疗,被称为治疗性克隆3 干细胞应用前景3.