实验一 植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌(3学时)

1、实验一 植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌（3学时）一、目的要求1、通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立组织培养的无菌意识；2、掌握组织培养室的消毒及灭菌方法。3、掌握培养用具的干热灭菌的一般操作技术。二、仪器与用具1、用具：喷雾器、工作服、口罩、手套等；2、药品：2%新洁尔灭，高锰酸钾，甲醛，70%酒精。三、方法步骤（一）植物组织培养室的灭菌1、地面、墙壁和工作台的灭菌：用2%新洁尔灭喷雾。（1）配方：取新洁尔灭原液20ml，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。（2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。（3）注意事项：墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏；注意安全

2、，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。（1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。（2）方法：首先房子要密封。然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。（3）注意事项：操作前要戴好口罩及手套；倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。操作时人要迅速避开烟雾；3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。4、用紫外灯照射

3、2030min。5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。（二）培养基的灭菌高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）（1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。（2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。（3）装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！）（4）装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。（5）灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0kpa时，开启排气阀，将锅内的

4、冷空气全部排出。当锅内压力达到108kpa时，温度为121时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌锅自然冷却。注意：先打开放气阀，再打开锅盖。（以免锅内压力大而爆炸！）开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30以下的室内，最好储藏在4-10的条件下。某些生长调节剂如iaa、zt、aba等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。2、培养用具的灭菌干热灭菌法玻璃器皿的灭菌：湿热灭菌法或干热灭菌法；金属器械的灭菌：干热灭菌或火焰灭菌法；布质制品的灭菌：均用湿热

5、灭菌法。（注意：布质制品绝不能干热灭菌！）干热灭菌方法：（1）洗涤：把组织培养用的培养皿、三角瓶、试管、移液管等玻璃器皿进行彻底清洗。（2）包扎：玻璃器皿可放在大的玻璃容器中，金属器械可放在金属盒内。（3）灭菌：器皿在烘箱中，150，干热灭菌1小时；或120，2小时。灭菌完毕，待冷却后取出。四、作业1、将本次实验内容整理成实验报告。2、简述组培实验室的灭菌过程和注意事项。实验二 ms培养基母液的配制与保存（3学时）一、目的要求1、通过ms培养基母液的配制，掌握配制培养基母液的基本技能；2、掌握培养基各种母液的保存方法。二、仪器与用具1、仪器：各类天平、磁力搅拌器、冰箱；2、用具：烧杯、容量瓶、

6、量筒、试剂瓶、标签；3、试剂：95%酒精，0.5-1 naoh，0.5-1nhcl，配制ms培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。三、方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10100倍。优点：（1）保证各物质成分的准确性；（2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。1、ms大量元素母液（10x）称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取100ml。化学药品1升量10升量nh4no31650 mg/l165gkno31900 mg/l190gcacl22h2o440 mg/l44gmgso47h2o370 mg/l37gkh2po4170 mg/l17g2

7、、ms微量元素母液（100x） 称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。化学药品1升量10升量mnso44h2o（ mnso4h2o）223 mg/l（214 mg/l）223mgznso47h2o 86 mg/l86mgcocl26h2o0025mg/l025mgcuso45h2o0025 mg/l025mgna2moo42h2o025 mg/l25mgki083 mg/l83 mgh3bo362 mg/l62 mg注意：cocl26h2o和cuso45h2o可按10倍量（025 mgx10=25 mg）或100倍量（25 mg）称取后，定容于100ml水中，每次取10

8、ml或1ml，即含025 mg的量。3、ms铁盐母液（100x）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。化学药品1升量10升量na2edta373 mg/l373 mgfeso47h2o278 mg/l278 mg 注意配制时，两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中edta盐较难完全溶解，可适当加热。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。4、ms有机物母液（100x）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。化学药品1升量10升量烟酸05 mg/l5mg盐酸吡哆素（vb6）05

9、 mg/l5mg盐酸硫胺素（vb1）肌醇100 mg/l1 g甘氨酸2 mg/l20mg5、生长调节剂单独配制，浓度为1-5 mg/ml（书中为05 -1mg/ml），一般配成4 mg/ml 。配制培养基母液时注意事项：一些离子易发生沉淀，可先少量水溶解，在按配方顺序依次混合；配制母液时用蒸馏水或重蒸馏水；药品应用化学纯或分析纯；溶解生长素时，可用少量05 1n的naoh 或95%酒精溶解，溶解分裂素类用05 1n的hcl加热溶解。如再加蒸馏水，易产生白色沉淀，此时可加入热水。（二）母液的保存1、装瓶：将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。（注意将易

10、分解、氧化者，放入棕色瓶中）2、贮藏：4冰箱。四、作业1、写出实验报告。2、配制培养基母液时应注意哪些事项？实验三 无菌操作技术外植体的消毒与接种（3学时）一、目的要求通过在超净工作台上进行无菌操作训练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。二、材料与用具1、材料：陆地棉（gossypium hirsutum l.）种子或其他培养材料。2、仪器：超净工作台，含ms培养基的大试管，镊子，培养皿，酒精灯，接种器械（解剖刀、剪子、镊子等）。3、试剂：70%酒精，95%酒精，0.1%升汞或漂白粉、无菌水等。三、方法步骤1、用水和肥皂洗净双手，穿上灭过菌的专用实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净

11、工作台和无菌操作室的紫外灯，照射20分钟。3、上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，然后用70%酒精喷雾降尘，并擦拭工作台面。4、先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。5、修整接种材料，除去不用的部分，然后进行外植体消毒：（1）水洗，滤纸吸干；（2）70%酒精中浸泡约30-60秒（注意：酒精穿透力很强，时间不宜过长，以免损伤材料组织细胞）；（3）在0.1%升汞中浸泡10分钟；或在10%漂白粉上清夜中泡10-15分钟；（4）无菌水冲洗3-5次。6、接种：将种子或其他培养材料放到培养基上。（1）先解开包口纸，将试管或培养瓶拿成斜角，使瓶口在酒精灯火焰上方灼烧数

12、秒钟。（2）用灼烧过的冷却的镊子取外植体材料转接到试管或培养瓶中，轻轻插入或放在培养基表面。（3）接种完毕后，将瓶口在火焰上转动灼烧，封口。（4）操作期间应经常用70%酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%酒精中浸泡和火焰上灼烧灭菌。注意：双手不能离开工作台，不能说话、走动或咳嗽等。7、接种结束后，清理和关闭超净工作台，并用70%酒精擦拭工作台面。四、作业1、将本次实验内容写成实验报告。2、接种一周后，观察接种材料是否污染，并分析如果污染，试分析污染的原因。实验四 胡萝卜离体根培养（3学时）一、目的要求1、学习胡萝卜离体根培养的基本方法；2、掌握诱导愈伤组织的基本技术。二、材料、仪器与试

13、剂1、材料：市售大而新鲜的胡萝卜2、仪器：超净工作台、灭菌锅、显微镜、接种器械、不锈钢打孔器、烧杯（500ml）、培养皿（9cm）、移液管；3、试剂：ms培养基 + 10 mg/l 2，4-d + 2 mg/l 6-ba，70%乙醇，0.1% 升汞(注：书本p77，配方为ms培养基 + 2，4-d + ch 500 mg/l)三、方法步骤1、将胡萝卜用自来水冲洗干净，用刮皮刀除去表皮1-2mm，横切成大约10-40mm 厚的切片。以下步骤全部无菌操作。2、胡萝卜片经70%乙醇处理30-60秒后，无菌水冲洗一遍，再用0.1% 升汞或饱和漂白粉溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗3-5次。3、将胡萝卜片平

14、放于培养皿中，一手用镊子固定胡萝卜片，一手用打孔器按平行于组织片垂直轴方向打孔。每个孔应打在靠近维管形成层的区域，务必打穿组织。然后从组织片中抽出打孔器，用玻棒轻轻将圆柱体从打孔器中推出，放到无菌水的培养皿中。重复打孔步骤，直至制备足够数量的组织圆柱体。4、用镊子取出-2条胡萝卜圆柱体，放入另一含无菌水的培养皿中，用刀片切除圆柱体两端各2mm长的组织。将剩下的组织切成厚约2mm的小圆片。在整个切割操作中要多次火焰消毒镊子和解剖刀，冷却后再使用。5、用镊子将圆片转到灭菌的滤纸上（每次一片），将圆片两面的水分吸干，并立即接种到培养基表面。每瓶接种6-8片。 注意：接种时使三角瓶呈一定的倾斜度，用手

15、拿镊子、灼烧等整个接种过程不要直接在培养基上方完成，以减少污染机会。6、将培养物置于25温箱中培养。可将一部分放在光下培养，一部分放在暗中培养，比较光下和暗处对诱导愈伤组织的反应。四、作业1、结果与观察：培养几天后，外植体表面开始变得粗糙，有许多光亮点出现，这是愈伤组织开始形成的症状。经数周培养后，将长大的愈伤组织切成小块转移到新的培养基上，进行继代培养，扩大繁殖。用放大镜观察愈伤组织表面特征。用解剖针挑取一些细胞置于玻片上，加一滴水，压上盖片，在显微镜下观察愈伤组织细胞的特征。2、将本实验的操作过程及实验结果整理成实验报告。实验五 玉米胚培养（3学时）一、目的要求1、学会种子胚的剥离方法。2

16、、掌握成熟胚培养的基本操作技术。二、材料、仪器与试剂1、材料：玉米成熟的籽实；2、仪器：超净工作台、灭菌锅、培养箱、电子天平、酸度计、培养皿、容量瓶、酒精灯等； 3、试剂：ms培养基，消毒剂，0.5 n -1n 的naoh和hcl三、方法步骤1、检查种子：将玉米种子放在盛有95%的乙醇中消毒10秒，再用蒸馏水冲洗。检查果皮是否完整，若有水进入果皮内而呈透明斑块的种子，应丢弃。保留果皮完整、外貌无改变的种子。2、种子消毒：70%乙醇30秒，0.1%升汞或10%氯酸钠溶液20分钟，无菌水冲洗3-5次。3、浸泡种子：种子泡在无菌水中1晚上。或者，在直径90mm的培养皿中放置1张湿润的无菌滤纸。在每张

17、滤纸上接3粒种子。于25黑暗下培育6小时，种子将吸水膨胀，变软。4、剥离种胚：取1粒种子放在无菌培养皿中，用镊子夹住，用另一把镊子轻轻剥去种皮（两者愈合在一起）。解剖刀沿着胚的边缘小心切除胚乳，暴露出位于其下方的种胚的一部分盾片，分离出胚。5、水洗胚胎：胚胎分离后，将每一个胚胎冲洗3次，然后移入装有培养基的三角瓶中，每瓶接种3个。6、培养：25黑暗环境培养。7、培养结果：大约培养2天后出现胚根，3-4天后出现胚芽，7-9天后初生根迅速生长并出现一些不定根，10天后可以长成小苗。四、作业 将本次实验过程写成实验报告，并写出实验观察结果。实验六、细胞分离与细胞悬浮培养（3学时）一、目的要求了解细胞

18、分离与细胞悬浮培养的全过程，学会整个细胞培养程序的实验方法和操作技术。二、材料、仪器与试剂1、材料：水稻种子；2、仪器：超净工作台、带相机设备及相同设备个光学显微镜、可变速离心机、玻璃过滤器、血细胞计数器、目镜及物镜测微尺、计数器、酸度计； 3、试剂：（1）培养基（ms、b5、n6）（2）植物激素（2，4-d、naa、kt）、二醋酸荧光素、酚藏红花或伊文思蓝等燃料。三、方法步骤1、愈伤组织的诱导、继代培养（1）外植体的表面消毒 挑选籽粒饱满的水稻种子，人工去掉谷壳，用70%酒精表面消毒2min,然后用2.5%次氯酸钠水溶液浸泡30min,期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次。（2）接种培养基表面

19、将消毒后的种子按每瓶3粒接种于琼脂培养基表面，置于暗条件下培养。（3）切割愈伤组织 3周后将形成的愈伤组织切割，并转移继代培养。（4）疏松愈伤组织 诱导形成的愈伤组织，其质地和物理性状有明显的差异，有的很坚实，有的很松散，需进行继代筛选。同时应考虑基本培养基中铵态氮与硝态氮的比例培养基中激素的含量及不同激素的比例，以及某些天然有机附加物对愈伤组织生长和形态的影响。培养基中加入酵母提取物（35g/l），将获得生长好、质地疏松的愈伤组织。（5）愈伤组织继代培养 由于愈伤组织的生理状态将直接影响以后的细胞悬浮培养，故应及时挑选幼嫩的部分接种转移。一般继代培养的间隔以2周为宜。2、单细胞的分离（1）愈

20、伤组织细胞的计数 用于分离单细胞的愈伤组织每克鲜重含若干细胞，可预先计数。称取1g幼嫩新鲜的愈伤组织，加入0.1%果胶酶（用培养液或0.6mol甘露醇作溶剂。配制后，用200g离心5min,取上清液，调节ph值为3.5）,放在25的培养室中1216h，再用电磁拖泥带水搅拌器低速搅动3min即可获得细胞悬浮液，然后用细胞计数板技术。（2）单细胞的分离 参照所测得的愈伤组织细胞数，称取适量的愈伤组织，放入含适量液体培养基的125ml三角瓶，置于110r/min旋转式摇床上振荡，暗培养，室温2528。（3）悬浮液的过滤 连续振荡3周后，用148m尼龙网过滤，以除去愈伤组织碎片及较大的细胞聚集体。经过

21、滤后，可获得95%左右的单个游离细胞。 单细胞的收集。过滤液用200g离心5min，收集单个细胞及小的聚集体。3、细胞悬浮培养（1）计算细胞起始密度 离心后将约2/3的上清液倒掉，剩下的1/3的大部分移入一预先消毒的125ml三角瓶中待用。离心管中最后剩余1ml上清液，摇动离心管，使沉淀悬浮。吸取1滴于血细胞计数板上，以游离单细胞为基数计算细胞的密度。 细胞计数方法：以上海医用光学仪器厂生产的血细胞计为例，吸取1小滴细胞悬浮液滴于记数板上，将盖玻片轻轻由一边向另一边盖下，轻压盖玻片使之与计数板完全密合，以免产生气泡影响计数。计数的原理详见产品说明书。计数时在显微镜视野中计数5个中方格中的细胞数

22、。这5个中方格指位于四个角与中央的中方格。每个样品重复计数5次，求其平均值。计算公式简化如下：细胞数/ml=5个中方格的细胞数501000（2）测定活细胞率 在医用血细胞计数器计算细胞密度的同时，用酚藏红花溶液和二醋酸酯荧光素溶液测定活细胞率。水稻种子的活细胞率可达50%左右。活细胞率的测定方法：先配制0.1%酚藏红花水溶液，溶剂为培养液。二醋酸酯荧光素则先用丙酮配成每毫升含5mg二醋酸酯荧光素的母液，储藏在冰箱中备用。使用时，用培养液稀释母液成0.01%的浓度。先将培养物和二醋酸酯荧光素溶液在载玻片上与上述溶液混合。酚藏红花能使死细胞染上红色，在染料与细胞悬浮培养物混合后，很快就可以在普通显

23、微镜下观察。活细胞不被酚藏红花染色，即使30min后也是如此。（3）细胞悬浮液培养 将上述（1）项中剩余的近1/3的上清夜倒入离心管中，并根据需要的起始刻度，补充加入新鲜的培养基。接种的三角瓶置于110r/min 的旋转式摇床上连续振荡培养，在室温（291）暗条件下培养，培养期间对悬浮培养的细胞定期计数细胞密度。（4）细胞团和愈伤组织的再形成 悬浮培养的单个细胞在3-5d内即见细胞分裂。经过一周左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂形成肉眼可见的小细胞团。（5）植株的再生 大约培养2周后，将细胞分裂形成的小愈伤组织团块（直径0.5-2.5mm）及时转移到分化培养基上，连续光照，室温（251）

24、。3周左右后即可分化出试管苗。待试管苗长至试管顶端时（大约在愈伤组织转至分化培养基后40d），取出洗掉琼脂，将根在0.1%烟酰胺水溶液中浸泡1h，然后移栽于塑料钵中，放入可照光和通入蒸汽的 塑料罩中1周，再移入玻璃温室中。四、实验报告 绘出细胞悬浮培养操作程序图，你认为其中哪些步骤可以改进，如何改进，请提出你的建议。小学常用歇后语1.八仙过海-各显神通 2.不入虎穴-焉得虎子3.蚕豆开花-黑心 4.车到山前-必有路5.打破砂锅-问到底 6.和尚打伞-无法无天7.虎落平阳-被犬欺 8.画蛇添足-多此一举9.箭在弦上-不得不发 10.井底青蛙-目光短浅11.大海捞针-没处寻 12.竹篮打水-一场空

25、13.打开天窗-说亮话 14.船到桥头-自会直15.飞蛾扑火-自取灭亡 16.百米赛跑-分秒必争17.拔苗助长-急于求成 18.仇人相见-分外眼红19.芝麻开花-节节高 20.新官上任-三把火21.瞎子点灯-白费蜡 22.兔子尾巴-长不了23.偷鸡不成-蚀把米 24.王婆卖瓜-自卖自夸25.老虎屁股- 摸不得 26.老虎拉车-谁敢27.老鼠过街-人人喊打 28.麻雀虽小-五脏俱全29.墙上茅草-随风两边倒 30.三十六计-走为上计31.塞翁失马-焉知祸福 32.壶中无酒-难留客33.丈二和尚-摸不着头脑 34.有借有还-再借不难35.猫哭耗子-假慈悲 36.铰子破皮-露了馅37.扁担挑水-一心挂了两头 38.对牛弹琴-白费劲39.八仙聚会-神聊 40.霸王敬酒-不干也得干41