免疫组化实验步骤汇总

1、石蜡切片免疫组化实验步骤 石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行 （From徐晓峰、朱老师的“石 蜡切片”方案）： 1）材料的准备 在本实验室条件下推荐使用 FAA （ 50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7%甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存： 无水乙醇 50ml 冰醋酸 5ml 37%甲醛 10ml 水 35ml 第一天：组织固定 用FAA固定，详见“石蜡切片” protocol 第二天：脱水 Solution time number of changes 50% etha nol 60 min utes one 60% etha nol 60 m

2、in utes one *70% etha nol 60 min utes one 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于 4C冰箱等待，并不时轻摇。 *组织可在70% ethanol 4C可存放几个月 第三天：进一步脱水和浸蜡 以下所有步骤在4C进行并不时轻摇 Solution time number of changes 85% etha nol 60 minu tes one 95% etha nol 60 minu tes one 以下所有步骤在室温进行并不时轻摇 Solution time number of changes 100% etha nol 30 minu tes two 1

3、00% etha nol 60 minu tes two 25%二甲苯，75% ethanol 30 minu tes one 50%二甲苯，50% ethanol 30 minu tes one 75%二甲苯，25% ethanol+番红 30 minu tes one 100%二甲苯 60 minu tes two 100% 二甲苯 + 1/4 volume Paraplast over ni ght Plus (paraffi n) chips (不要摇动.) 准备工作：60C预热plus蜡片(Paraplast Plus)石蜡可反复融凝而 去气泡 第四天：浸蜡2 将材料置于42C直至蜡

4、块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全 熔化后移至60C。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜 第五天：浸蜡 3 换蜡两次 (Paraplast Plus) 第六天：浸蜡 4 换蜡两次 (Paraplast Plus) 第七天：浸蜡 5 换蜡两次 (Paraplast Plus) 准备工作： 60C预热 Regular蜡片(Paraplast Regular) 第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后： 开始切片， 切片应包括自己的片子及正负对照等。 事先打开烘片机至 37 度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加 12ml 的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片

5、过夜。 用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用 第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片” protocol） Solution time number of changes 100%二甲苯 10 min utes two 100% etha nol 1-2 mi nu tes two 95% etha nol 1-2 mi nu tes one 90% etha nol 1-2 mi nu tes one 80% etha nol 1-2 mi nu tes one 60 % etha nol 1-2 mi nu tes one 30 % etha nol 1

6、-2 mi nu tes one water 1-2 mi nu tes one PBS(PH=7.4) 5 mi nu tes one PBS(PH=7.4) 5 mi nu tes one （用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220250毫 升） 抗原修复： 在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗 12 遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液（PH=6.0）,煮沸（保持在95度左 右），将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片1015 min。然后将 电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲 液中一起自然冷却至室温！ ！) 将片子浸入 PBS(

7、PH=7.4)5 min。 重复一遍。 封闭： 在抗原修复时可以事先配制封闭液，用PBS( PH=7.4)配制3% BSA 的封闭液。 将PBS中的切片放入封闭液中，室温放置 30分钟1小时。 杂一抗： 在封闭时可先剪好与切片大小相当的封口膜， 并准备加有少量水的 塑料大盒， 用卫生纸垫在塑料大盒中附带的塑料板上。 用封闭液稀释 一抗(GFP兔多抗以1:100稀释，其它一抗需要另外尝试)。将稀释完 的一抗加在片子上，每张片子保证不少于100ul,用封口膜封上，检 查是否有汽泡，轻轻赶走气泡。将片子放在塑料大盒中，盖上塑料盖 子，放入冰库过夜。 杂二抗： 事先配制好TBS(PH=7.4)缓冲液，

8、用TBS (PH=7.4)缓冲液稀释带 有碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔二抗，比例为 1:200。将塑料大盒从冰 库中拿出，浸入TBS (PH=7.4)缓冲液中洗一抗，5min,重复3次, 在洗一抗的过程中准备封口膜。 将片子上的残余缓冲液倒去 (但片子 必须保持湿润！）每张片子加不少于 100ul 的二抗稀释液，盖上封 口膜，放入塑料大盒中，室温放置 11.5 小时。 洗二抗并显色 用TBS（PH=7.4）缓冲液洗二抗，5min,重复3次。同时在暗处配制显 色液（40ul溶液A+40ul溶液B+720ul水，可根据实际切片数量按比 例配制显色液），剪切封口膜。 将片子至于暗处， 倒去缓冲液，每张片子加不少于 100ul 的显色液， 轻轻盖上封口膜，放于暗处进行显色。每隔 15 分钟左右看一下片子 是否开始显色 （根据经验， 加入显色液 30min1 小时会开始显色 ,但是 需要根据不同蛋白表达强弱，把握显色时间 ）。发现显色之后需加蒸 馏水终止反应，再盖上盖玻片进行观察并拍照。 试剂： 1. 0.01M PBS( PH=7.4): 购买的小包装粉末，溶于 1L 水中，待粉末溶解后调 PH 值至 7.4。 2. TBS: 2.4g Tris, 8.8g