布病实验室技术培训安课件

1、布病实验室技术培训安1 陕西省陕西省CDCCDC鼠布生防科鼠布生防科 安翠红安翠红 布病实验室技术培训安2 布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏 菌属（Brucella）的细菌侵入机体，引起 传染变态反应性的人畜共患传染病。 布鲁氏菌病简称布病。 布鲁氏菌简称为布氏菌。 布病实验室技术培训安3 布病布病 病原学病原学 及实验及实验 室检验室检验 1 2 3 布氏菌的生物学特性布氏菌的生物学特性 布氏菌的抗原及毒力布氏菌的抗原及毒力 布病实验室检验布病实验室检验 布病实验室技术培训安4 发现和分类位置发现和分类位置 31.1 抵抗力抵抗力 31.3 形态和培养特征形态和培养特征 1.2

2、 布鲁氏菌菌的生物学布鲁氏菌菌的生物学 特性特性 1 布病实验室技术培训安5 1.1 布氏菌的发现 1887年英国军医Bruce首先从死于 “马耳他热”的英国士兵的脾脏中分 离出羊种布氏菌。 布病实验室技术培训安6 1.1布鲁氏菌的分类学位置 微生物分类学家将布氏菌归为布鲁 氏菌属（Brucella），下分6个种19个生 物型。 布病实验室技术培训安7 羊种布氏菌（Bvr.melitensis）1，2，3型； 牛种布氏菌（Br.abortus）1，2，3，4，5， 6，7，9型； 猪种布氏菌（Br.suis）1，2，3，4，5型； 沙漠森林鼠种布氏菌（Br.neotemae）； 绵羊附睾种布氏

3、菌（Br.ovis）； 犬种布氏菌（Br.canis）。 布病实验室技术培训安8 自1952年起，在人畜间共分离出3个种 233株布鲁氏菌，其中羊种菌227株，占总 数的97.4%。牛种3株、犬种3株。1991年 以前流行优势种型为羊1、2型，1996年后 则为羊1、3型 。 陕西省是以羊型菌为主、牛、犬种布鲁氏 菌病的混合疫区。流行优势种随时间推移 发生了变化。 布病实验室技术培训安9 布氏菌属的细菌是一组微小的球杆状的 革兰氏染色阴性菌。柯氏染色，布氏菌 染成红色，其他菌染成绿色或蓝色。 宽0.30.6m，长0.61.5m。无芽 孢、无鞭毛、无质粒、不形成荚膜。 一般说来，羊种菌最小，牛种

4、菌次之， 猪种菌最大。 布病实验室技术培训安10 布病实验室技术培训安11 营养条件高，生长缓慢，生长所需温度为 20-40，最适温度为37 .通常要经过4-6 天，有的甚至要经过20-30天（双相培养基） 才能长出菌落。 布病实验室技术培训安12 对物理因子的抵抗力对物理因子的抵抗力 对化学因子的抵抗力对化学因子的抵抗力 不同环境中的抵抗能力不同环境中的抵抗能力 对抗生素的敏感性对抗生素的敏感性 布病实验室技术培训安13 对物理因子的抵抗力对物理因子的抵抗力 布病实验室技术培训安14 对化学因子的抵抗力对化学因子的抵抗力 布病实验室技术培训安15 布病实验室技术培训安16 现已证明，布鲁氏菌

5、对四环素最 敏感，其次是链霉素，而对枯草杆 菌肽、多黏菌素B、多黏菌素M素等 有很强的抵抗力。 布病实验室技术培训安17 布氏菌的抗原、毒力布氏菌的抗原、毒力 布氏菌的抗原、内毒素布氏菌的抗原、内毒素 32.1 布氏菌的毒力布氏菌的毒力 2.2 2 布病实验室技术培训安18 布氏菌的抗原成分十分复杂，存在A、M、G成分。A对牛 种布氏菌有特异性，M对羊种布氏菌有特异性，G为两种 菌共有。还与多种细菌存在共同抗原，因而有血清交叉反 应。布氏菌不产生外毒素，只产生内毒素，有致热、致炎 作用，可导致休克。 布氏菌的抗原及内毒素布氏菌的抗原及内毒素 32.1.1 布病实验室技术培训安19 从种上来说，

6、羊种毒力最强，猪种和牛种 次之，犬种的毒力很弱，几乎不引起人致 病。 布氏菌的毒力布氏菌的毒力 32.1.2 布病实验室技术培训安20 由于菌种毒力等因素的不同，患病后的临 床表现也不完全一样。 羊 种布鲁氏菌的毒力最强,患者中毒症状严 重，多有典型的发烧、多汗、头痛、虚弱、 关节痛、肝脾及睾丸肿大等急性症状。 猪种、牛种次之。 犬种的毒力很弱，几乎不引起人致病。 布病实验室技术培训安21 布氏菌实验室检验布氏菌实验室检验 3 细菌学检验细菌学检验 33.1 血清学检验血清学检验 3.2 布病实验室技术培训安22 诊断布病的金标准。 3.1.1实验室要求 布氏菌的分离培养要在生物安全二级以上实

7、验 室中进行。 布氏菌是高致病性病原微生物，从危害程度来说 为第二类病原微生物。 细菌学检验细菌学检验 33.1 布病实验室技术培训安23 3.1.2方法 采样（采血） 双相培养基 菌株鉴定 （菌落形态观察、涂片、染色、 镜检布氏菌诊断血清玻片凝集试验） 种型鉴定（CO2需要与否、H2S的产生的测 定、染料抑菌试验、单项因子血清凝集试 验、噬菌体裂解试验等等） 细菌学检验细菌学检验 33.1 布病实验室技术培训安24 3.1.3 布氏菌培养特性 布氏菌是需氧或微需氧菌 生长缓慢，尤其初代分离 牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在5-10% CO2环境中培养 新长出的菌落无色透明，光滑圆形，突起，

8、均质， 直径1-2mm 液体培养均匀混浊，无菌膜 粗糙型菌落较大，生长快 布病实验室技术培训安25 3.1.4 布氏菌培养检查材料 人或动物的全血、 动物流产胎儿（胎儿的肝脏、肺、胃内容物） 动物脏器、动物胎盘、关节液、阴道分泌物等 新鲜乳汁 布病实验室技术培训安26 3.1.5 样品的采集 血培养：急性期、体温反应明显和血清滴度高的病人，血 培养阳性率高 血培养阳性率与病期、体温反应、临床表现以及血清滴度 等有关系 骨髓培养：慢性期病人骨髓培养的阳性率比血液高 从胸腔积液、脓肿和关节液、痰、乳、阴道分泌物 流产胎盘中分离到布氏菌 新鲜乳汁 布病实验室技术培训安27 布病实验室技术培训安28

9、布病实验室技术培训安29 布病实验室技术培训安30 布病实验室技术培训安31 布氏菌革兰染色 布病实验室技术培训安32 分离培养 纯分离传代 玻片凝集初步鉴定，阳性血清、因子血清凝集 H2S产生试验，CO2培养依赖试验 噬菌体裂解试验 染料抑菌试验 PCR检测 其他方法检测 生化测定 脂肪酸分析 PFGE等 布病实验室技术培训安33 我国1981年起从国外引进布氏菌分型噬菌 体，对鉴定布氏菌有良好使用价值，可以 将布氏菌鉴定到种 目前使用的噬菌体有 Tb Fi BK 2 Wb R R/O R/C 布病实验室技术培训安34 布病实验室技术培训安35 布病实验室技术培训安36 商用培养基 布氏琼脂

10、 布氏肉汤 制备培养基 肝浸液琼脂 血琼脂培养基 胰蛋白眎琼脂培养基 半固体培养基 选择性培养基添加剂（多种抗生素） 商品添加剂 多粘菌素B 杆菌肽 放线菌酮 制霉菌素 注意：PH 7.2 ，琼脂适量，适当容器 布病实验室技术培训安37 新方法的应用 细菌生化 鉴定系统 PCR鉴定 OMP31 AMOS-PCR 布病实验室技术培训安38 布病实验室技术培训安39 布病实验室技术培训安40 血清学检验血清学检验 3.2 3.2.1 血清学诊断的意义 3.2.2 针对布病进行的检验 3.2.3 血清样本的采集和保存 布病实验室技术培训安41 人的布病诊断方法：综合性诊断 （1）流行病学接触史：密切

11、接触家畜、野生 动物（观赏动物）、畜产品、布氏菌培养物等 或生活在疫区内的居民 （2）临床症状和体征 （3）实验室检查：病原菌分离、试管凝集试 验、补体结合试验、抗人球蛋白试验 具备（1）、（2）和（3）项中的任何一 项检查阳性即可确定为布病病人 布病实验室技术培训安42 实验室检查阳性判定标准 （1）病原菌分离：检出布鲁氏菌 （2）试管凝集试验：1：100（+）及以上 （3）补体结合试验：1：10（+）及以上 （4）抗人球蛋白试验：1：400（+）及以上 （5）虎红、平板凝集试验：出现可见凝集 （6）皮内变态反应：皮试后24、48小时分别各观 察一次,皮肤红肿范围有一次在2.2.厘米及以 上

12、（或.平方厘米及以上） 布病实验室技术培训安43 虎红、平板凝集试验和皮内变态反应供 初筛试验用 对已确诊的慢性病人和接种过菌苗的人， 应以临床症状为主要依据，血清学试验 效价高低，皮内变态反应强弱供参考 布病实验室技术培训安44 试管凝集试验 (SAT) 虎红玻片凝集试验 (RBPT) 含巯基化物处理血清后的凝集试验（2ME 试验） 抗球蛋白试验 (Coombs试验) 补体结合试验 (CFT) 乳环凝集试验 (MRT) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 金标法 荧光偏振方法 （FPA） 布病实验室技术培训安45 布病实验室技术培训安46 布病实验室技术培训安47 布病实验室技术培训安48 虎

13、红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂玻片、 微量移液器、枪头。 方法：在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎 红平板抗原0.03ml，充分混匀，5min之内观察结 果。 结果判定：出现可见的凝集反应就判为阳性；否 则就为阴性。 评价：简便快速、容易操作，漏检率极低，适用 于基层大面积检疫；容易出现假阳性，临床上需 要借助SAT来确认。 布病实验室技术培训安49 血清静止的温度和时间对实验结果有很大 的影响，在一定的时间和温度范围内，防 治时间越长，温度越高，假阳性率越低； 患者空腹血清出现假阳性少； 凡是试验中凝集颗粒不规则，大小不匀， 片状或絮状，凝集不清澈者，一般为假阳 性，否则凝集颗粒

14、规则，大小均匀，凝集 清澈者，一般与SAT结果相符，为阳性。 布病实验室技术培训安50 原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体 产生特异性抗体，这种抗体可与相应的布 氏菌抗原发生特异性结合，在电解质的作 用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也 就是用已知抗原查未知抗体。 布病实验室技术培训安51 布病实验室技术培训安52 布病实验室技术培训安53 布病实验室技术培训安54 布病实验室技术培训安55 实验凝集抗原、被检血清、生理盐水 移液器、吸管、凝集管、试管架、稀释抗原用的玻璃杯、 37度温箱。 方法：每份血清取9支小试管，放于试管架上。 血清稀释 稀释抗原后；加入抗原 温育18-22小时 室温放

15、置2小时后观察结果 比浊管配置 布病实验室技术培训安56 2.3 0.50.50.50.50.50.50.50.5 1:1600 布病实验室技术培训安57 比浊管的制备 + + + + 生理盐水（ml） 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 稀释抗原（ml） 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 1.00 0.75 0.50 0.25 0.25 0.50 0.75 1.001.001.00 1.00 1.00 布病实验室技术培训安58 结果判定： 根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程度（滴度），特别是 50%清亮度（+）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判 定。

16、 + 液体完全透明，菌体成伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集。 + 液体近于完全透明，菌体成伞状沉淀，呈75%凝集。 + 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈50%凝集。 + 液体不透明，管底有很不明显的伞状沉淀，呈25%凝集。 液体不透明，无伞状沉淀。 效价以产生50%凝集的血清最高稀释倍数为受检血清的效价。 血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀浑浊，两种对照管成立，才 可判定试验管，否则重做。 人的诊断标准：1:100+为阳性，1:50+为可疑。 布病实验室技术培训安59 实验室诊断标准之一 滴度1100及以上或病程一年以上者滴度为1 50及以上为阳性 特异好，实用性、敏感性强

17、主要检查血清中的IgG和IgM，适合于急性期病人 的诊断。 缺点：有前带现象，有时出现假阴性结果；长生 一定的交叉反应；出结果慢，需要两天 布病实验室技术培训安60 受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放 血清处温度不能超过10，采血后应于3-4 日内进行检查，因放置时间过长可能会导 致血清效价降低。 每份血清和抗原要有对照。 个别血清会出现前带现象，建议多做几个 管，多采用几个稀释度。 布病实验室技术培训安61 原理：机体受布氏菌抗原刺激后可产生“完全抗体”和 “不完全抗体”。不完全抗体可与相应抗原结合，但不出 现可见反应。若将预测不完全抗体的人血清球蛋白作为抗 原，注射于另一种动物（常用家兔

18、）制成抗球蛋白（抗 IgG、IgA、IgM）的抗体，再将此球蛋白抗体加入到抗原 与不完全抗体复合体中，即可出现可见反应。分为两个阶 段: 不完全抗体与相应抗原结合为不可见阶段 抗原抗体复合物有抗球蛋白抗体凝集而形成可见反应 评价：所查抗体主要是IgG、IgA；可以作为早期和追溯诊 断；适用于亚急性和慢性病人；操作复杂，耗时长，一般 不作为常规检查项目。 布病实验室技术培训安62 试剂：试管凝集抗原、被检血清、抗被检对象的 血清球蛋白抗体、生理盐水 器材：普通离心机、温箱、1ml及10ml吸管。 方法：试管凝集试验阶段 抗球蛋白反应阶段 吸取上项试验的可疑 管和全部阴性管，4000转/分离心15

19、分钟，反复洗 涤3次。向各管中加入生理盐水0.5ml，混匀，再 向各管中加0.5ml一定稀释度的抗球蛋白血清，将 反应管置37温箱中20-22小时，取出室温放置2 小时后判定结果。 判定标准同试管凝集试验 布病实验室技术培训安63 被检血清对照（被检血清+盐水） 试管凝集抗原对照（试管抗原+盐水） 抗球蛋白血清加生理盐水对照 抗球蛋白血清加试管凝集抗原对照 抗球蛋白血清加被检血清对照 对照全部为阴性时，实验才有意义 我国试行的用于诊断人布病标准1:400及以 上滴度。 布病实验室技术培训安64 在进行Coombs试验时，洗涤抗原很重要， 如不认真洗涤，在抗原表面上吸附血清中 的某些其他蛋白物质，会干扰下一步加入 抗球蛋白血清的反应，掩盖真正结果。 一般采用加入抗球蛋白血清1:20-1:50之间 的稀释度。 布病实验室技术培训安65 （1）布氏菌感染后，约在15天出现不完全 抗体，3个月左右达到高峰。可持续一年左 右。该实验可作为早期和追