组织切片操作流程.doc

1、 切片法主要步骤1、取材与固（1）取材：从动物体取下所需的器官材料。取材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立即取材，防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄（以不超过0.5cm为宜），不能挤压和损伤。（2）固定：将所取的材料立即投入固定液中，目的是使组织蛋白迅速凝固，使细胞内的结构和成分不再发生变化，保持组织细胞与活体相似的形态结构，固定后的组织块变硬，便于进一步处理。常用的固定剂有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液。实验室常用bouin固定液，固定时间为1224小时，其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。 2、脱水与透明 （1）脱水：固定后的组织块内含有的大量水分要

2、彻底脱去，以便石蜡的浸入。常用的脱水剂为乙醇，脱水过程必须循序渐进，从低浓度开始，逐步升高，使组织块中的水分逐渐被乙醇所取代。具体操作为：bouin固定液固定的组织块可直接进入70的乙醇进行脱水，时间12小时左右。（若材料暂不制片，可保存于70乙醇中。）然后将组织块依次移入85乙醇（）、（）各8-12小时，95乙醇（）、（）各2小时，100乙醇（）、（）各1小时。因无水乙醇对组织有脆化作用，故在无水乙醇中时间不能超过2小时。 （2）透明：由于乙醇与石蜡不能相溶，故浸蜡前要对脱水后的组织块进行透明。常用透明剂有二甲苯、氯仿、苯、香柏油或冬青油等，透明剂能同与乙醇和石蜡相溶，并能增强组织块的折光系

3、数，故透明后的组织块呈半透明状。使用二甲苯作透明剂的透明过程为：将脱水后的组织块放入无水乙醇与二甲苯混合液（1:1）中30分钟，再移入二甲苯中15-20分钟。 3、浸蜡与包埋 （1）浸蜡：将透明后的组织块置于刚过熔点的熔化石蜡中浸渍，使石蜡逐渐渗入并完全置换出透明剂。过程为：先将透明的组织块移入二甲苯与石蜡混合液（1:1）中，在60温箱中放置30分钟，再移入熔化的石蜡（）、（）、（）中，在温箱中每级各1小时。 （2）包埋：将浸蜡后的组织块置于盛有熔化石蜡的模具中，并使之凝固成蜡块。4、切片与贴片 （1）切片：将修整后的蜡块夹在切片机的固定器内，使蜡块的被切面与刀口平行，刀和蜡块成一斜角，以右手

4、摇动摇柄进行切片，切片厚度以58um为宜，连续操作可形成蜡带，此时左手持毛笔轻轻取下蜡带，放于盒中。 （2）展片：将切下的蜡片放于温水（约40）的表面，使皱褶自然舒展开来。 （3）贴片：借助分离针或镊子，将蜡片贴在洁净载玻片上。贴片后，将切片置于切片架上自然干燥或放入温箱（40左右）中烘干。 5、染色与封固 （1）染色：染色后可增加细胞和组织中各结构间色彩的对比以便于观察。切片的染色方法很多，常用的是苏木精（hematoxylin）伊红(eosin)染色，简称he染色。染色的具体步骤如下： 脱蜡：将切片放入二甲苯（）、（）中，各置510分钟，溶去切片上的石蜡。 将脱蜡的切片经各级浓度乙醇（由高

5、到低）下行至水：将从二甲苯（）中取出的切片依次经过：二甲苯与无水乙醇混合液（1:1）无水乙醇（）无水乙醇（）95%乙醇85乙醇70乙醇各35分钟，最后在蒸馏水中浸5分钟，即可进行染色。 切片由蒸馏水中转入苏木精染液染色510分钟，使细胞内的嗜碱性物质着色。用自来水洗去切片上残余的染液。0.51盐酸溶液分色数十秒钟。放入自来水中1520分钟、蓝化。置入70、85乙醇中各35分钟。置入伊红染液中染色12分钟，使细胞中嗜酸性 物质着色。依次进入95乙醇（）、（）100乙醇（）、（），各5分钟，以除去切片上水份。透明：切片入无水乙醇与二甲苯混合液（1:1）二甲苯（）、（）（），各5分钟。 zzz 常用

6、固定液和染液的配制 bouin固定液的配制 饱和苦味酸溶液 75份 甲醛 25份 冰醋酸 5份 由于bouin固定液的各种成分一旦混合，若不立即 使用将会失效，故bouin固定液只能现配现用。苏木精染液的配制 （1）harris苏木精染液 甲液： 苏木素 0.5g 95乙醇 5.0ml 乙液： 硫酸铝钾（钾明矾） 10g 蒸馏水 100ml 氧化汞 0.25g 冰醋酸 几滴 先将甲液用玻棒搅拌使苏木精溶解，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，并加热使之溶解，去火；迅速加入甲液，煮沸后，再去火；立即加入氧化汞后再煮沸；将此液迅速冷却后用滤纸过滤，加入几滴冰醋酸即可。此液可保存数月。苏木精染液的配制 han

7、sen苏木精染液 甲液： 苏木素 1g 95乙醇 10ml 乙液： 硫酸铝钾（钾明矾） 20g 蒸馏水 200ml 丙液： 过锰酸钾 1g 蒸馏水 16ml 将三液分别溶化，然后将甲液注入乙液，再加入丙液3ml，时时搅拌，加温至煮沸0.51分钟，迅速冷却。0.5伊红染液的配制将0.5g伊红溶于100毫升95乙醇中即可。 0.5盐酸溶液配制将0.5毫升盐酸加入100毫升蒸馏水固定后处理及切片 一、 洗涤与修切 1、水洗法 一般常用流水冲洗，凡用含铬或锇的固定液固定的组织块，必须用流水冲洗24h左右。常用的固定液为10%的甲醛水溶液，也必须用流水冲洗，一般时间也为24h左右，固定时间长的标本，冲洗

8、时间也应延长。 2、酒精洗涤法 凡含苦味酸或酒精的固定液固定的组织块，大多采用酒精洗涤，如苦味酸影响着色，但易溶于70%酒精。三、 脱水与透明 （一）、脱水的意义与目的 组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水，脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。脱水时必须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂，以防组织过度收缩而变形，或脱水不完全而影响制片效果。脱水剂必须具有下列特性:脱水剂能与水按比例混合；高浓度，一般指不含水分；脱水剂也能与透明剂混合。 2、透明或媒浸 （1）二甲苯：是最常用的常规透明剂，它对组织的收缩性强，易使组织变硬变脆，在二甲苯中一般30

9、min即可使组织透明，组织块可先经过无水酒精-二甲苯混合液处理，再浸入二甲苯。也常用于切片染色后透明，且不会使染料退色。 （2zzz）苯和甲苯：对组织收缩性较小，与二甲苯相比不易使组织变脆，但透明速度慢且挥发快，适用于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透明。 3、浸蜡 组织经透明后，在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56，在夏天较热时一般用高熔点石蜡，在冬天气温较低时用低熔点石蜡，主要是有利于切片的制作。时间不易过长，否则容易造成组织脆硬，时间不足，也难制作良好的切片。（一）、石蜡包埋法 石蜡包埋法为组织学技术中最常用的一种包埋法。石蜡具有不同的熔点，夏天一般用5

10、0以上熔点（硬蜡）石蜡包埋，冬天用50以下熔点（软蜡）石蜡包埋，软的组织用软蜡包埋，硬的组织用硬蜡包埋，一般常用的包埋熔点使52-56，如果需要切4微米以下的切片，则用56-60 的石蜡，较厚的切片则用熔点为52-54的石蜡。新蜡必须在温箱内溶化一次，以使其所含的挥发性物质蒸发，无论新蜡和旧蜡都必须加热过滤后再包埋。（二）、石蜡包埋法包埋过程 组织块透明后，即可放入已熔的石蜡内浸蜡；一般厚度约5mm的实质性器官，总的浸蜡时间约2-3h，均在恒温箱内进行。较理想的的浸蜡温度是石蜡刚溶化的温度，或在蜡杯底部尚残留一小部分未熔完蜡时的温度，浸蜡完成后，即做成包有组织的蜡块。包埋蜡块的器材有专用的包埋框，也有自己制作的包埋盒，只要是具有一定形状的容器，我们都可以把它用作包埋盒。包埋的具体过程详述。b:切片用品准备 （1）切