医学免疫学与病原生物学实验指导

1、医学免疫学与病原生物学实验指导（供三年制护理学专业使用）主编 穆春晓 谢 涛 副主编 洪 宇 王 力编者 李慧霞 林君荣辽东学院医学院基础医学教学部实 验 室 规 则实验是验证理论，并对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。为保证实验效果，同时避免病原生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：一、尽量不带个人生活用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。二、进入实验室后穿上白大衣，离室时脱下反叠带走。在实验室内应保持安静、整洁、有序；不得高声谈笑、随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部

2、及身体其他暴露部位。四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应立即报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离开。第一部分 医学免疫学实验实验一 凝集反应与沉淀反应【实验目的】1掌握凝集反应的原理、参加要素及临床意义。2. 掌握沉淀反应的原理、参加要素及临床意义。【基本原理】 抗

3、原与抗体的结合具有特异性，所以可以用已知抗原检测未知的抗体，或是用已知的抗体检测未知的抗原。1凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合能出现肉眼可见的凝集现象。2沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线。一、凝集反应（一）玻片直接凝集反应 菌种鉴定 【目的】 观察细菌在玻片上与其相应抗体结合所出现的细菌凝集现象，理解抗原抗体反应的特异性。【原理】 将已知细菌抗体与待测细菌混合，如果抗原与抗体相对应，则引起细菌凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断细菌种类。【材料】11：20痢疾杆菌免疫血清，1：20伤寒杆菌免疫血清。2痢疾杆菌培养物。3生理盐

4、水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯、消毒缸等。【方法】1取洁净玻片1张，用记号笔划分三等份，如下图所示：n s 伤寒杆菌免疫血清 痢疾杆菌免疫血清+ + +痢疾杆菌 痢疾杆菌 痢疾杆菌2用接种环分别取生理盐水、1：20伤寒杆菌免疫血清、1：20痢疾杆菌免疫血清各34环按图示位置放在玻片上，注意在换取另一种血清时要烧灼接种环，以免混淆血清产生错误结果。3用接种环挑取少量痢疾杆菌加入玻片的生理盐水中，充分混匀，再挑取少量痢疾杆菌加人1:20伤寒免疫血清中混匀，同法挑取痢疾杆菌加入1：20痢疾杆菌免疫血清中，混匀。注意无菌操作。4轻摇动玻片，12分钟后观察。【结果观察】阳性：液体变清，并有乳白色凝集块

5、出现。阴性：液体仍然混浊，无凝集块出现。记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。 -+（阴性）（阳性）【注意事项】 取细菌培养物时不宜过多，与免疫血清混合时，必须将细菌涂散、涂均匀，但不宜将面积涂得过大，以免很快干涸而影响结果观察。（二）试管直接凝集反应 血型抗体效价滴定 【目的】 了解试管凝集反应方法；掌握凝集效价的判定及其意义。【材料】 1a或b型试者血清、生理盐水。2a或b型红细胞悬液。3小试管、试管架、吸管。437恒温培养箱等。【方法】 1取7支小试管，标17号。2按下表加样，将待检血清进行倍比稀释。在第17管内加入红细胞悬液各0.5 ml。（注意：加样顺序由

6、后往前加）充分混匀后，置37恒温箱30分钟后观察记录结果。表1-2 试管凝集实验方法和结果举例试管号 1 2 3 4 5 6 7 （对照） 生理盐水（ml） 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 待检血清（ml） 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 （弃0.5） 红细胞 （ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 血清稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 37温箱放置 30 分钟结果判定 + + + + + 【结果观察】先观察生理盐水对照管（第7管），应不发生凝集，液体混浊，管底沉淀呈圆形，边缘整齐。此沉淀

7、物为红细胞悬液静置时因重力作用自然下沉形成。然后自第6管开始依次观察管内液体的混浊程度及管底凝集块的大小。【血清对倍稀释方法】用吸管将第1管的溶液连续吸吹三次，使其充分混匀后吸出0.5 ml移入第2管（先反复练习吸吹方法，待掌握操作方法后再进行正式试验），同法使充分混匀后吸出0.5 ml 移入第3管，如此作倍比稀释至第6管，从第6管吸0.5 ml弃去，第7管为不加血清对照。【结果判定】 凝集物 上清液 凝集程度 全部凝集 澄清 +（最强凝集） 大部份凝集 基本透明 + （强凝集） 有明显凝集 半透明 + （中度凝集） 很少凝集 基本混浊 + （弱凝集）不凝集 混浊 （不凝集）【孔底凝块观察】+

8、 + + + 【凝集效价（血清凝集滴度）的判定】通常以能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（+）的血清最高稀释度为血清凝集效价。上表所示结果，血清效价为1：160。（三）间接凝集反应（类风湿因子检测）【原理】 类风湿因子（ rheumatoid factor rf）是抗人或动物iggfc段的抗体，是以变性igg为靶抗原的自身抗体。igm型rf被认为是rf的主要类型，也是临床免疫检验中常规方法所测定的类型。igg吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上作为检测试剂，在反应介质中，待检血清中如含有rf，可与胶乳颗粒出现凝集反应。这是检测igm型rf的常用方法，但此方法只能定性或以滴度半定量，其灵敏度和特异性均不

9、高，且只能检出血清中的igm型rf。 【方法】 胶乳颗粒凝集试验即一定稀释度的待检血清+ig-胶乳颗粒12滴，观察凝集与否。（四）间接凝集抑制试验-乳胶妊娠试验【原理】 将待测样品中的抗原与已知抗体作用后，再与相应抗原乳胶颗粒混合。因没有游离抗体的存在，乳胶颗粒表面的抗原不能与抗体结合出现凝集现象，即凝集被抑制。孕妇尿液中含hcg，用抗hcg与之结合后，再加hcg乳胶，则不出现凝集现象。【方法】 1取玻片一张，左侧加生理盐水一滴，右侧加待检尿液一滴。2两侧各加抗hcg（hcg诊断血清）一滴，混匀2分钟。3两侧各加hcg乳胶抗原一滴，混匀2分钟，观察结果。【结果分析】 左侧对照实验：出现均匀的凝

10、集颗粒。妊娠诊断试验阴性：出现凝集现象，即凝集未被抑制，说明待检尿液中无hcg。妊娠诊断试验阳性：不出现凝集，即凝集被抑制，说明待检尿液中有hcg。 凝集不凝集（试验阴性）（试验阳性）【理论联系实际思考题】1依据试验原理，分析实验结果。2叙述玻片直接凝集试验的临床应用。3间接凝集试验与直接凝集试验比较有何优点？二、沉淀反应（一）环状沉淀反应【目的】 掌握环状沉淀实验的原理、操作方法、结果判断及用途。【原理】 在口径很小的环状沉淀试管中，将一定稀释度的抗原溶液加于抗体血清之上，使二者直接在液相中相互扩散，抗原与相应抗体结合后，于两液交界面上形成白色沉淀环。【材料】1试剂：兔抗人血清；人血清稀释液

11、；动物（如羊、豚鼠等）血清稀释液；生理盐水。2其他：环状沉淀试管；毛细吸管。【方法】1取3支环状沉淀试管，注明管号。2用毛细吸管在、管中各加入兔抗人血清0.2ml。3倾斜环状沉淀试管，用毛细吸管吸取人血清稀释液0.2ml沿管壁缓缓加入管中抗体之上，将沉淀管直立，并使抗原抗体二者呈一清晰界面。用同样的方法在管加动物血清稀释液0.2ml、在管中加入生理盐水0.2ml。4.室温中静置1020分钟，观察两液交界面有无白色沉淀环形成。【结果观察与分析】两液交界面有白色沉淀环者为环状沉淀实验阳性，无白色沉淀环者为阴性。【注意事项】1加血清的过程中不要形成气泡。2加抗原时应沿管壁缓缓加入，毛细吸管尖勿触及抗

12、体部分，避免抗原与抗体混合。3实验时抗体的浓度应大于抗原的浓度。【理论联系实际思考题】1试述环状沉淀实验的原理。2试述该实验的临床应用范围。（二）凝胶沉淀反应1双向琼脂扩散试验【原理】 常用于定性检测，也可用于半定量检测。将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶板上相邻近的小孔内，让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白，作为原发性肝癌的早期辅助诊断。甲种胎儿蛋白（-fetal protein，afp），是胎儿组织及体液中的正常组织成份。胎儿在第

13、9周才出现此种蛋白，1319周达高峰，到21周后逐渐下降，胎儿出生后该蛋白即行消失或含量甚微，普通试验方法检查不出，而肝癌病人及个别卵巢癌或睾丸癌病人的血清检出有此种蛋白。【材料】1抗afp血清、已知肝癌病人afp阳性血清、待检病人血清。21.2%琼脂（用生理盐水配成）。3载玻片、毛细吸管、湿盒。【方法】1制备琼脂玻片：将已知加热溶化的1.2%琼脂3.5ml，迅速倾入载玻片上。2打孔、加样：待凝固后用打孔器按下图样打孔（孔径3mm，孔距4mm）。以上方孔为第1孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5和6孔，中央孔为7孔。7孔加入抗afp血清，1、4孔加入已知afp阳性血清（或afp），作为阳性对

14、照孔；6孔加入已知afp阴性血清，作为阴性对照孔，其余2、3、5孔为试验孔，加入待检血清。2、3、5孔待检血清为afp阳性4温育 置湿盒室温或37温育1224 h。【结果观察】 1、4孔与7孔间应出现白色沉淀线（如上左图1与7，4与7），6与7孔间应不出现白色沉淀线。若2、3、5孔与7孔间出现白色沉淀线而且与阳性对照沉淀线吻合者如图中2、3、5与1、4孔间，即为实验阳性，表明待检血清中含有afp（即afp阳性）。如出现与阳性对照相连接，且呈枪刺状如上右图中4与5孔间，说明二者间有共同抗原成分；如出现成交叉的沉淀线如上右图3与4，则是非特异性沉淀反应，为假阳性反应，乃判为实验阴性，表明待检血清为

15、afp阴性。2对流免疫电泳【原理】 在一定条件下，胶体颗粒是带有电荷的，这些带电胶体颗粒在电的影响下发生移动。如胶体颗粒带负电，则移向阳极；反之，移向阴极。这种现象称为电泳。对流免疫电泳是将病人血清（待检抗原）放在琼脂板阴极端孔内，已知抗血清（含有已知抗体）放于阳极端孔内，在碱性环境条件下同时进行电泳，抗原由阴极向阳极移动快，而抗体系丙种球蛋白，等电点在ph67之间，故带负电荷少，移动速度慢，由于电渗作用结果向阴极倒退，于是抗原抗体在电场中相遇，当两者比例适当时，则特异性抗原抗体互相结合，便形成肉眼可见的白色沉淀线。【材料】11%，ph8.6，0.075m巴比妥缓冲液。2抗afp血清，已知af

16、p阳性血清，待检病人血清。3玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、电泳仪等。【方法】1将用缓冲液配制好的1.2%琼脂隔水加热溶化，趁热吸取3.5ml加于玻片上，冷凝后打孔，孔直径3毫米，二孔间距离3毫米。2分别从上至下向左列1、3、5孔内加入抗afp血清；向右列2孔内加待检病人血清，4孔内加已知afp阳性血清作为阳性对照，6孔内加已知阴性对照血清。各孔加满为度，勿使外溢，3将琼脂板置于电泳槽内，抗原端入阴极侧，抗体放阳极侧，二端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。4通电，固定电压56伏/厘米长，通电4560分钟左右。【结果观察】电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察3与4孔间

17、（阳性对照组）、5与6孔间（阴性对照组）的白色沉淀线是否出现；再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为afp阴性血清。 ab+ 11 -ag -ag 【理论联系实际思考题】1.在双琼脂扩散实验中，加入过量的抗原可增加沉淀线的清晰度吗？为什么？2.如何分析双琼脂扩散实验结果？第二部分 医学微生物学实验实验二 细菌的染色与形态结构观察【实验目的】1. 掌握革兰染色与抗酸染色的基本程序和判断标准，明确革兰染色与抗酸染色的实际意义。2. 掌握油镜的使用及保护方法，熟悉油镜的原理。3. 熟悉细菌的基本形态与特殊结构。【实验原理】 一、革兰染色原理 1.细胞壁学说：革兰阳性细菌细胞壁肽聚糖是具

18、有5肽交联桥的三维结构，且层数多（1550层，2080nm），含量丰富(占细胞壁干重50%80%)；革兰阴性菌细胞壁肽聚糖没有5肽交联桥，形成的是不牢固的二维结构，层数少（12层，1015nm），含量较低(占细胞壁干重10%20%)，并且含大量脂质成分的外膜占细胞壁干重的80%以上。当用95%酒精脱色时，阳性细菌细胞壁破坏较小，结晶紫-碘复合物不易脱去；阴性细菌细胞壁大部分被溶解，结晶紫-碘复合物容易脱掉。 2.等电点学说：g+菌等电点（ph23）比g-菌等电点（ph45）低，在一定的ph环境中，前者带有的负电荷数量多于后者，故与带正电荷的结晶紫染料结合能力更强，不易脱色。3.化学学说：g+菌

19、细胞质内带有较多的核糖核酸镁盐，可与碘-结晶紫复合物形成更大分子的复合物，在细胞内不易脱色。而g-菌只含有少量核糖核酸镁盐，因此，较g+菌易脱去颜色。二、抗酸染色原理抗酸染色是将固定的标本先经石炭酸复红加温染色，再用盐酸酒精脱色，最后用美蓝复染。抗酸菌被染成红色，经脱色被复染成蓝色者为非抗酸菌。结核杆菌为细长略带弯曲的杆菌，因细胞壁中含有大量脂质、蜡质、分支菌酸等，故一般不易着色，需经加温或延长染色时间才能着色，一旦着色后，能抵抗盐酸酒精的脱色作用，故用抗酸染色法对其染色，其为抗酸菌，被染成红色。此法在直接镜检结核病人标本时有一定诊断意义。三、显微镜油镜原理光线在不同媒质中的传递速度不同，因而

20、，在由一个媒质进入另一个媒质中时，可产生折射作用。为了使透射光线不被折射掉，在载玻片和油镜头间加入同玻璃折光率比较接近的香柏油（或液体石蜡），最大限度的使光线进入物镜，提高成像率。（见图12）【实验材料与仪器】一、革兰染色1. 标本：葡萄球菌与大肠杆菌的混合菌液（新鲜菌液）。2. 革兰染色液：结晶紫染液；碘液；95%乙醇；稀释石炭酸复红染液。3. 其他：载玻片；酒精灯；接种环；吸水纸；玻璃笔；香柏油；擦镜纸；二甲苯。4.仪器：光学显微镜。二、抗酸染色1标本：消化肺结核患者痰标本。2抗酸染色液：石碳酸复红；3%盐酸酒精；美蓝。3其他：载玻片；酒精灯；接种环；吸水纸；玻璃笔；香柏油；擦镜纸；二甲苯

21、；玻片夹。三、细菌形态观察1.球菌：葡萄球菌；链球菌；淋球菌。2.杆菌：大肠杆菌；炭疽杆菌；枯草杆菌。3.螺形菌：霍乱弧菌；幽门螺杆菌。四、细菌特殊结构标本1.荚膜：肺炎链球菌；炭疽杆菌。2.鞭毛：变形杆菌；霍乱弧菌。3.芽胞：破伤风杆菌；枯草杆菌。【实验方法及内容】一、革兰染色 （自做）1.细菌涂片标本的制备： 点燃酒精灯，在酒精灯上方用接种环取混合菌液一环，缓慢涂于载玻片中央，形成直径约1cm的涂层。将玻片反复在酒精灯上方通过几次，对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。2.革兰染色过程：结晶紫染色（1min，水洗）卢戈氏碘液媒染（1min，水洗）95%酒精脱色（30-40s,水洗）稀释复红

22、染色（30s,水洗）吸干待检。3.标本观察将标本滴加镜油，置于油镜下观察细菌的颜色与形态。二、抗酸染色 （自做）1涂片、干燥、固定：以蜡笔划一大小为2.0cm2.5cm的椭圆形圈，用接种环挑取痰液中脓样黄绿色部分或血丝部分在圈中作厚膜涂片，自然干燥，微火固定。 2初染：在涂片标本上放一滤纸片（其作用是滤去染液中的沉淀，并防止加热过程中染液外溢），在滤纸上滴加石炭酸复红液，将玻片置于火焰上方微微加热，待蒸汽出现，维持5min，去掉滤纸片，等冷却后水洗。 3脱色：滴加3%盐酸酒精脱色30s60s，轻轻摇动玻片，直至无红色流下为止，水洗。4复染：用吕氏碱性美兰复染60s，水洗，吸干，油镜检查。三、油

23、镜使用方法 （自做）（一）熟悉光学显微镜基本构造 1.熟悉显微镜基本结构 （图11）2.显微镜保养注意事项（1）载物台要保持清洁，勿将油或水留在台上。（2）观察标本时，缓慢调节粗调节器，发现标本后，再调节细调节器，直至标本清晰。严格禁止直接利用细调节器寻找标本。原则上，细调节器的旋转在正反方向上不应超过三周，以免损坏微螺旋。（3）注意物镜油镜头的保护，浸入镜油中时，切忌将镜头顶在载玻片上，以免划伤镜片。观察结束后，用擦镜纸轻轻拭去镜头上的油渍，或用二甲苯擦拭镜头及镜片，防止镜油对镜头的侵蚀或影响透光率。 （4）在不观察标本时，应及时关闭自带光源显微镜电源开关，一方面延长灯泡的使用寿命，同时也可

24、节约用电。 （5）使用完毕后，将显微镜套上防尘罩，置于干燥处存放，注意防止潮湿，避免阳光直晒。（二）油镜下观察细菌基本形态、特殊结构与革兰染色、抗酸染色取细菌染色标本片一张，在标本染色部位滴加一滴香柏油，将标本片置于显微镜载物台上，调整至集光器中央位置。选择好油镜头，将油镜头浸入镜油中，旋动粗调节器，缓慢抬升油镜头，待标本出现后，再旋转细调节器进行微调，直至图象清晰。 图11 光学显微镜基本构造 图12 油镜的原理【实验结果与判定】1. 革兰染色结果：记录并绘制观察到的细菌颜色、形态及排列方式。紫色：g+菌；红色：g-菌。2抗酸染色结果：结核杆菌为细长、直的或微弯曲杆菌，呈红色，为抗酸染色阳性

25、。标本的其余部分及非抗酸菌被染成蓝色。3. 记录并绘制所观察到的细菌基本形态和特殊结构模式图。【注意事项】 一、革兰染色1.涂片后注意要干燥、固定，以免标本被冲刷掉。2.注意每个步骤的时间控制，尤其是95%酒精脱色时间和均匀度的控制，否则会直接影响染色结果。3.待检混合菌液要用新鲜培养物洗液。二、抗酸染色1在涂片后烧灼接种环时，为防止痰中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，然后再于外焰灭菌。 2在初染加热时，切记染液不可沸腾，出现蒸气即暂时离开，若染液因蒸发减少时，需随时补加，以防烤干。 3把握好脱色时间，最长不要超过1 min。三、油镜的使用1.调整浸在油中的物镜时，要控制好方向和调整的距离

26、，切忌将载玻片顶碎，损伤油镜头；用后将镜头用二甲苯擦拭去油。2.按操作规程使用油镜，观察标本时要多观察几个视野，选取细菌标本的典型形态和结构。【理论联系实际思考题】 1.革兰染色的原理及意义。 2.革兰染色最关键的是哪一步？此时阳性菌和阴性菌各应该是何种颜色？ 3.为何要用油镜观察细菌？4从医学角度讲，细菌特殊结构有何意义？5结核杆菌的形态染色有何特点？实验三 细菌的人工培养与代谢产物观察【实验目的】1. 掌握细菌接种的无菌操作基本方法，观察细菌在不同培养基中的生长现象；通过进行细菌人工接种培养，建立无菌操作观念。2. 熟悉细菌在各种人工培养基上的生长繁殖特点。3. 熟悉常用细菌培养基种类及应

27、用范围。4. 了解培养基的制备原则和基本程序。【实验原理】 1.根据细菌对营养的基本需求及所要达到的培养目的，确立细菌培养方案，设定培养基配方及制作程序。通过提供氮源、碳源、无机盐、水等基本营养成分，调整适合的氢离子浓度，以满足细菌生长繁殖的营养需求；最后，经高压蒸汽灭菌，制备出不同用途的无菌培养基。2.在同时满足细菌生长的温度条件和气体条件后，细菌可以在所提供的培养基内分裂、繁殖，形成肉眼可见的培养物。根据培养目的的不同，可以利用多种培养基进行不同类型的细菌培养。【实验材料与仪器】1.药品：牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；琼脂；naoh；hcl；蒸馏水。2.菌种：葡萄球菌；大肠杆菌；葡萄球菌-大肠杆

28、菌混合菌液。3.培养基：普通肉汤培养基；固体斜面培养基；固体平板培养基；半固体培养基。4.仪器：天平；高压蒸汽灭菌器；电热恒温干燥箱。5.其他：三角烧瓶；烧杯；试管；培养皿；移液管；精密ph试纸。酒精灯；接种环；接种针。【实验方法及内容】一、制备培养基的基本原则和程序（示教） 1.基本原则 满足细菌的基本营养需求；提供适度的ph环境；通过灭菌操作达到培养基的无菌标准；封装、冷藏保存。 2.基本程序 按比例称取营养物质熔于定量蒸馏水调整营养液ph值过滤除杂质（加琼脂的需要过滤）分装、加塞（平板培养基灭菌后再分装）灭菌冷却、备用。二、常用培养基制作（示教） 1.普通肉汤培养基 称取牛肉膏5g、蛋白

29、胨10g、氯化钠5g加入1000ml蒸馏水中加热溶解调整ph7.4-7.6分装试管、加塞高压蒸汽灭菌（1.05kg/cm2，121.3；作用1530min）冷却后备用。 2.普通琼脂培养基 配制1000ml肉汤培养基加入2030g琼脂加热溶解过滤调整ph7.4-7.6分装试管、加塞（制作平板培养基时，待整体灭菌冷却至5060后再以无菌操作分装至灭菌培养皿内）高压蒸汽灭菌（条件同上）摆斜面冷却备用（斜面培养基）。 3.半固体培养基 配制1000ml肉汤培养基加入35g琼脂加热溶解过滤调整ph7.4-7.6分装试管、加塞高压蒸汽灭菌（条件同上）直立冷却备用。4.血琼脂平板培养基 配制普通琼脂培养基

30、，灭菌后冷却至5060，以无菌操作加入5%10%脱纤维无菌动物血，再以无菌操作分装平皿，冷却备用。三、细菌的人工培养 （自做）（一）固体斜面培养法 （图21）1.左手拇指、食指、中指及无名指平行握持斜面培养基试管及待接种菌试管，斜面朝上。2.右手持接种环，在酒精灯火焰上方灼烧灭菌并冷却。3.于酒精灯火焰上方无菌区域内，用小指及小指与无名指间指缝夹取两个试管塞，迅速用灭菌的接种环刮取少许菌苔，以划蛇形线方式转接至新培养基内。4.接种完毕，塞紧试管塞。灼烧接种环后放回原处。将试管做好标记，37培养过夜。此法适合菌种传代或保藏菌种。 图21 固体斜面接种法（二）肉汤增菌培养法（图22）1.2.同上。

31、3.于酒精灯火焰上方无菌区域内，用小指及小指与无名指间指缝夹取两个试管塞，迅速用灭菌的接种环刮取少许菌苔，接种至倾斜液体培养基试管壁位置。4.接种完毕，塞紧试管塞。灼烧接种环后放回原处。将试管做好标记，37直立培养过夜。此法适合快速增菌培养。图22 液体培养基接种（三）半固体培养法（图23）1.2.同上。3.于酒精灯火焰上方无菌区域内，用小指及小指与无名指间指缝夹取两个试管塞，迅速用灭菌的接种针沾取少许菌苔，由试管中央穿刺接种至半固体培养基内3/4处，并按穿刺线退出接种针。4.接种完毕，塞紧试管塞。灼烧接种针后放回原处。将试管做好标记，37直立培养过夜。 此法适合观察细菌运动能力，判断是否具有

32、鞭毛。图23 半固体穿刺接种（四）固体平板划线分离培养法1.分区划线分离培养（图24）右手持接种环，在酒精灯火焰上方灼烧灭菌并冷却后，取混合菌液一环。左手中指、无名指及小指水平托住平板培养基平皿底部，拇指及食指夹住平皿盖，在酒精灯火焰上方无菌区域内将皿盖打开。右手将沾好菌液的接种环在培养基平面上呈30-45。角平行划线，划到培养基1/4区域时停止，此为第一区域。再将接种环灼烧灭菌，冷却后向第二区划线，前23条线通过第一区域，后面几条可以不通过。依此类推，再划3、4区。接种完毕，盖好皿盖。灼烧接种环后放回原处。将培养皿做好标记，37倒置培养过夜。此法适合含菌量较大的混合菌标本分离培养。图24 平

33、板分离培养2.连续划线分离培养同前。右手将沾好菌液的接种环在培养基平面上呈30-45。角平行划线，由一端划向另一端，覆盖整个培养基。接种完毕，盖好皿盖。灼烧接种环后放回原处。将培养皿做好标记，37倒置培养过夜。此法适合含菌量较小的混合菌标本分离培养（如咽拭、棉拭等）。四、细菌的代谢产物观察 （示教）1色素：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、铜绿假单胞菌。2糖代谢产物观察：大肠杆菌、痢疾杆菌五糖发酵试验结果观察。【实验结果与判定】 观察并记录细菌在培养基中的生长现象： 1.肉汤培养基 浑浊生长；沉淀生长；菌膜生长。 2.固体斜面培养基 斜面表面布满菌苔（注意有无色素）。 3.半固体培养

34、基 无鞭毛细菌：细菌沿穿刺线生长，不向周围扩散；有鞭毛细菌：细菌沿穿刺线生长，同时向周围扩散，在穿刺线周围的培养基中有细菌生长现象。4.固体平板培养基 观察混合菌液培养物是否出现单个菌落。黄色菌落为金黄色葡萄球菌，无色透明或半透明菌落为大肠杆菌菌落。图25 各种细菌菌落形态示意图【注意事项】1.接种细菌操作动作要规范，姿势要正确。2. 严格注意无菌操作，所有操作都应在酒精灯附近完成。3.平板划线接种时，要掌握好力度和角度，防止划破培养基；划线要均匀布满培养基表面，密集而不重复。4.穿刺线要直，进出在一条线上。【理论联系实际思考题】1. 培养基制作需遵循的基本原则和基本操作程序。2. 常用培养基

35、根据物理形态分为哪几种？各有何主要用途3. 做细菌培养接种时主要应注意哪些方面？4. 简单说明如何对临床混合细菌标本进行分离？实验四 微生物的分布及理化因素对细菌的影响【实验目的】1. 掌握常用物理、化学消毒灭菌法，熟悉原理，熟练操作。2. 掌握k-b纸片法药敏实验原理和基本方法，认识药敏试验的重要性和意义。3. 熟悉细菌在空气、水、物体表面及人体体表和体内的分布，进一步建立无菌观念。4熟悉细菌耐药性变异的产生机制及预防原则。【实验原理】 一、微生物的分布通过不同途径，采集各种状态下微生物标本，经过培养观察，证明微生物的分布状态。二、物理、化学消毒法原理1.热力消毒灭菌 加热可以使细菌细胞蛋白

36、质变性凝固，核酸解链崩裂，直接破坏蛋白和核酸，达到杀灭细菌的目的。湿热由于其穿透性强并能释放出潜热，可以比干热更有效的灭菌。 高压蒸汽灭菌法是根据压力与水沸点成正比的原理，通过加压，使密闭容器内温度升高至120以上，达到比较彻底的灭菌目的。 2.紫外线杀菌 紫外线波长范围200300nm，其中265266nm为细菌dna主要吸收峰。dna吸收紫外线后，光能转变为化学能，相邻嘧啶碱基容易形成嘧啶二聚体，从而干扰dna复制，使细菌出现致死性突变。 3.化学消毒剂消毒灭菌 不同的化学消毒剂性质不同，对细菌的杀菌作用主要包括三个方面：使菌体蛋白质变性或凝固；干扰细菌酶系统活性，影响细菌代谢；直接损伤细

37、胞壁或细胞膜。三、 药敏试验原理将浸有一定浓度的抗生素药物纸片干燥后，放在已接种某种细菌的平板培养基上。培养1824h，在不同抗生素纸片周围，敏感细菌会出现大小不等无细菌生长的抑菌圈，不敏感细菌则无抑菌圈或只有很小的抑菌圈。根据抑菌圈直径大小，判断细菌对抗生素的敏感程度。此法为kirby-bauer法（k-b纸片法）。图31 药敏试验抑菌圈的测量【实验材料与仪器】1. 培养基：普通琼脂平板培养基；血琼脂培养基。 2. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌固、液体培养物。3. 仪器：恒温培养箱；高压蒸汽灭菌器；紫外线杀菌灯。4. 药敏纸片：青霉素10u/片；链霉素；庆大霉素；红霉素10g/片。5. 其

38、他：无菌平皿；无菌试管；无菌移液管；无菌棉拭子；酒精灯；镊子；接种环；2.5%碘酒；70%酒精。【实验方法及内容】一、微生物的分布 （示教）1.在空气中分布：取无菌普通琼脂平板培养基，分别在室内室外打开皿盖，暴露空气中10min和30min，做好标记后送37培养24h。观察培养基中菌落数量和种类。2.水中分布：用无菌试管装入河水、自来水，再用无菌移液管分别取试管中的河水、自来水1ml于两个无菌平皿内，将两支溶化好的高层琼脂培养基冷却至4555，迅速倾注于上述两个平皿内并进行混匀，冷却后得平板培养基2个。37培养24h，在平板菌落观测器上观察、计数培养基中菌落数量，得出1ml液体中的细菌总数。3

39、.皮肤及物体表面细菌分布：取普通琼脂平板培养基一个，在皿底部划出四个区域：将拇指在1区培养基上轻轻压涂一下；用无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水，在纸币上涂抹后，再在2区培养基上涂抹；同操作，对象是实验台面，在3区培养基上涂抹；同操作，对象是自己手中的笔杆，然后在4区培养基上涂抹。操作完毕后，37培养24h，观察培养基中菌落数量和种类。4.人咽部细菌分布 用无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水后，在咽部深处擦拭，然后将棉拭子在血琼脂平板培养基上进行分区划线涂布。培养基置37培养24h，观察细菌生长现象，根据菌落特点和溶血情况做简单分析。二、紫外线杀菌试验 （示教）1.分别取大肠杆菌、取枯草杆菌密集划线接种普通琼

40、脂平板培养基。2.取一无菌黑纸片，分别置于接种后的培养基中央。3.将上述培养基在超净工作台内打开1/2皿盖，距离紫外灯50cm处分别照射5min、15min、30min、60min，置37培养24h。4.观察培养结果。三、细菌耐药性变异的产生机制及预防原则 （示教）四、药物敏感试验（kb纸片法） （自做）1.接种细菌 取两个琼脂平板培养基，用玻璃笔在皿底划分4个部分并注明抗生素简称。用无菌棉拭分别蘸取所提供的两种菌液，以划线涂布方式接于两个平板培养基内，分三次平行均匀涂布，后两次涂布前将平皿旋转60，并注意培养基边缘涂布均匀。 2.放置药敏纸片 将涂布细菌的培养基在室温条件下放置5min，稍干

41、燥后用无菌镊子夹取药敏纸片紧贴于培养基表面的固定区域内，每次取药敏纸片时应将镊子灼烧灭菌。3.培养观察 将放好药敏纸片的培养基送37培养1824h，观察抑菌圈大小，用格尺量取抑菌圈直径，判断细菌对该药物的敏感程度。【实验结果与判定】 一、微生物的分布1.空气中分布 注意观察室内、室外细菌数量和种类有何不同；同一环境下，暴皿10min、30min细菌数量有何不同。 2.比较自来水、河水中细菌分布数量上的不同。 3.观察手指、钱币、实验台面、笔杆上细菌分布的数量和种类。4.观察咽拭血培养菌落数量和溶血情况。二、紫外线杀菌试验紫外线杀菌效果随时间的延长更加有效，对产生芽胞细菌作用效果差。三、药物敏感

42、试验结果抑菌圈大小反映出细菌的敏感程度。参考衡量标准如下：6mm以下，不敏感；610mm，低度敏感；1015mm，中度敏感；15mm以上，高度敏感。【注意事项】1.操作过程应遵循无菌操作程序。2.使用紫外线杀菌时，人的眼睛和皮肤要避免受到紫外线的直接照射。3.制作药敏纸片时要精确均匀，使每个纸片上带有的药品量相同；平时保存时应干燥、冷藏。4.涂布细菌要均匀、密集，注意培养基边缘的细菌分布。5.药敏纸片放置要平贴培养基，切忌跷起。6.量取抑菌圈直径时应注意通过中心点，并注意抑菌圈边缘是否整齐。 【理论联系实际思考题】1. 正常菌群的存在有何意义？2. 化学消毒剂是如何发挥杀菌效果的？使用中应注意

43、哪些问题？3. 细菌药敏试验有哪些实际意义？4如何防止细菌耐药性的产生？实验五 脓汁标本中葡萄球菌的分离鉴定（一）（综合实验）【实验目的】1 熟悉常用的细菌感染检查方法与防治原则。2 熟悉脓汁标本中葡萄球菌的分离、鉴定程序。【实验原理】致病菌感染的诊断除根据临床症状、体征和一般检验外，还需采取合适的标本进行细菌学、血清学或分子生物学等检查。这种检查对病因诊断、药物治疗和疾病监控等方面均极为重要。化脓性感染为临床常见的细菌感染，多为病原性球菌引起，不同的细菌菌体形态及排列情况各不相同，有些细菌还可以产生颜色各异的色素。以无菌方法，采集化脓性感染病灶部位的标本或选用菌种，接种相应的培养基，选择适当

44、的方法培养，如果标本内有化脓性球菌生长，即可根据菌落特点、形态、溶血环的大小和颜色及染色性等作出初步的判断。【实验材料与仪器】1菌种或临床标本：金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌；甲型溶血性链球菌；乙型溶血性链球菌。2培养基：普通琼脂平板；血琼脂平板。3培养物：金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌在普通琼脂平板或血琼脂平板上的生长现象；甲型溶血性链球菌；乙型溶血性链球菌；肺炎链球菌在血琼脂平板上的生长现象。4试剂：革兰染色液。【实验方法及内容】一、常用的细菌感染的检查方法与防治原则 （示教）二、葡萄球菌菌落观察 （示教）在普通琼脂平板上，35oc培养1824h三种葡萄球菌均形成中

45、等大小、圆形凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明菌落，并可产生不同的脂溶性色素，使菌落呈现不同颜色：金黄色葡萄球菌呈金黄色、表皮葡萄球菌大多呈白色、腐生葡萄球菌大多呈柠檬色。在血琼脂平板上，三种葡萄球菌的菌落特点与普通琼脂平板上的菌落相同，但金黄色葡萄球菌菌落周围有完全溶血环（溶血），而腐生葡萄球菌和大多数表皮葡萄球菌菌落周围无溶血环。三、链球菌菌落观察 （示教）链球菌在血琼脂平板上生长后出现灰白色、圆形凸起，表面光滑、边缘整齐的针尖大小菌落，菌落周围可出现不同的溶血情况。甲型溶血性链球菌菌落周围出现草绿色溶血环（溶血），乙型溶血性链球菌菌落周围出现透明溶血环（溶血）。肺炎链球菌在血琼脂平板

46、上的菌落细小、灰白色、圆形略扁、半透明、有草绿色溶血环（溶血），培养23天后，因菌体自溶，菌落中心凹陷呈“脐状”。四、革兰染色 （自做）取洁净载玻片一张，进行标记，分区。用接种环分别挑取葡萄球菌、甲溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌涂片，进行革兰染色，在显微镜下观察、记录各菌的形态、排列方式、染色性并绘图。五、制定脓汁标本中葡萄球菌的分离、鉴定程序 （自做）根据理论课内容自己归纳、总结。六、脓汁标本的分离培养 （自做）【实验结果与判定】 记录各项培养结果，描述菌落特征及溶血情况，记录细菌镜下排列方式及染色特点。【注意事项】1.严格无菌操作，防止实验室感染及意外事故的发生。2.观察葡萄球菌菌落注意颜

47、色的区别，观察链球菌菌落注意溶血环的区别。【理论联系实际思考题】1.在血平板上形成透明溶血环的细菌是？各有何特点？2.如何区别金黄色葡萄球菌与白色葡萄球菌？甲型溶血性链球菌与乙型溶血性链球菌？3.有草绿色溶血环（溶血）的细菌能否致病？实验六 脓汁标本中葡萄球菌的分离鉴定（二）（综合实验）【实验目的】1通过触酶试验来区别葡萄球菌与链球菌。2通过血浆凝固酶试验和甘露醇试验来区别金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。【实验原理】1葡萄球菌能分解过氧化氢，触酶试验阳性。链球菌触酶试验为阴性。2金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，结合凝固酶附着于细菌表面，在玻片上

48、形成凝块；游离浆凝固酶则可使试管中的血浆发生凝固。3金黄色葡萄球菌能分解甘露醇产酸。【实验材料与仪器】1标本：待检菌（上次实验的培养物）；凝固酶阴性对照菌株。2试剂：新鲜兔血浆或人血浆；生理盐水；3%过氧化氢；甘露醇培养基。 3其他：玻片；接种环；试管【实验方法及内容】一、球菌的检查方法与防治原则（示教）二、触酶试验 （过氧化氢酶试验）1挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上。2滴加3过氧化氢溶液12滴，静置。三、血浆凝固酶试验1玻片法 取未稀释的新鲜兔血浆或人血浆和生理盐水各1滴分别滴于载玻片上，挑取少许待检菌，分别与生理盐水和血浆混合，立即观察结果。此法用于测定结合凝固酶。2试管法 取3

49、支10mm100mm试管，各加0.5ml14稀释的新鲜兔血浆（或人血浆），在其中1支试管中加35个待检菌菌落，充分研磨混匀，另2支试管中分别加凝固酶阳性菌株和阴性菌株作对照，置37oc水浴中孵育34h，观察结果。此法用于测定游离凝固酶。四、甘露醇发酵试验取待检菌接种到甘露醇培养液中，置37培养24h。【实验结果与判定】一、触酶试验滴加过氧化氢后，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。葡萄球菌触酶试验为阳性，链球菌触酶试验为阴性。二、血浆凝固酶试验1玻片法 细菌在生理盐水无凝集现象，而在血浆中能凝集成团块状，为血浆凝固酶试验阳性；反之，细菌在血浆中呈均匀混浊则为阴性。 2试管法：细

50、菌使试管内血浆凝固，呈胶冻状，与凝固酶阳性菌株对照相同，为血浆凝固酶试验阳性；反之，试管内血浆不凝固仍流动的，与凝固酶阴性菌株对照相同，则为阴性。金黄色葡萄球菌的凝固酶阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的凝固酶阴性。三、甘露醇发酵试验发酵甘露醇产酸培养基颜色发生改变者为阳性。金黄色葡萄球菌发酵甘露醇，为阳性；表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌不发酵甘露醇，为阴性。【注意事项】1.血浆凝固酶实验一定做盐水、阳性菌株和阴性菌株作对照。2.血浆凝固酶实验阴性的葡萄球菌，也可引起感染，如菌血症、尿路感染等。【理论联系实际思考题】1做血浆凝固酶实验有什么实际意义？你认为那种方法好，为什么？2如何区分致病的葡萄球菌

51、与不致病的葡萄球菌。实验七 常见肠道杆菌的分离鉴定（一）常见肠杆菌科细菌的培养物观察【实验目的】熟悉大肠埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属的菌落特点、菌体形态及染色性。【实验原理】以无菌方法，采集可疑粪便标本，血液、脓汁、尿液等标本或选用菌种，接种相应的选择培养基（ss、emb）、血液琼脂平板等，选择适当的方法培养，如果标本内有可疑细菌生长，即可根据菌落特点、形态及染色性等作出初步的判断，并为进一步鉴定指示方向。【实验材料与仪器】1菌种或临床标本：大肠埃希菌；伤寒沙门菌；福氏志贺菌。2培养基：血液琼脂平板；ss平板；emb平板或mac平板等。3培养物：将菌种或临床标本接种于血液琼脂平板、ss平板、emb平板，经37oc培养 1824h观察结果。4试剂：革兰