大鼠PDGF―C基因真核表达载体的构建与鉴定

1、大鼠PDG C基因真核表达载体的构建与鉴定 ：Objective To construct and identify a eukaryotic expression plasmid of rat PDGF-C gene. Methods An rat PDGF-C gene fragment was amplified and sequenced ， then cloned into pEGFP-N1 to construct the eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-PDGF-C. The recombinant plasmid was ident

2、ified by using double restriction enzyme digestion. Results The RT-PCR product was a gene fragment with 1053bp ， and the nucleotide sequence of that was consistent with the sequence of the rat PDGF-C gene registered in GenBank. The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-PDGF-C was identi

3、fied and verified as correct by double restriction enzymedigestion. Conclusion A recombinant eukaryotic plasmid of rat PDGF-C gene was successfully constructed. 血小板源生长因子 C( Platelet-derivedgrowth factor C， PDGF-C是近些年发现的PDGF家族新成员，在动脉粥样硬化、 高血压、纤维化疾病以及肿瘤的发生发展中具有重要意义 1 。 设计并构建PDGF-C基因的真核表达载体，为后续相关研究提供 研

4、究基础。 1 资料与方法 1.1 一般资料pEGFP-N1真核表达载体由本实验室保存。限 制性内切酶 Bglll和Sall、T4DNA连接酶、LA Taq聚合酶 （带 2XGC Buffer I ）、dNTPs 及 pMD18-T载体购自 TaKaRa公司； RevertAidTM First Strand cDNASynthesis Kit 购自 Fermentas 公司；Trizol Reage nt 、DH5 况感受态细胞、DNA Marker、DNA 回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自天根生物XX公司；引物由上 海生工生物XX公司合成；SD大鼠购自宁夏医科大学实验动物中 心。 1.2 方法

5、 1.2.1大鼠PDGF-C基因的克隆与测序 根据已发表大鼠 PDGF-C基因序列（GenBank Accession No. NM_031317 ），应用 primer premier 5.0软件设计合成大鼠 PDGF-C基因的CDS扩增 引物。上游引物：5- GAAGATCTATGCTCCTCCTCGGCCTC下游 引物： 5-ACGCGTCGACCCCTTCTGTTTGCCTCTACACAC-3， 在上下 游引物的 5 端分别引入 Bglll 和 Sall 的酶切位点，并加入保护 碱基，由上海生工生物技术 XX公司合成。Trizol试剂提取SD 大鼠肝脏组织总 mRN,反转录得到cDNA

6、在LA Taq酶作用下 进行 PCRT增。反应条件：94C 5min ； 94C 45s , 57C 45s , 72C 50s，循环30次；72C 10min。PCR产物胶回收后，连接 到pMD18-T载体上（命名为T-PDGF-C，转化后小量提取该质 粒，酶切鉴定后送上海生工生物技术XX公司进行测序。 1.2.2 pEGFP-N1-PDGF-C 重组质粒的构建与鉴定 用内切酶 Bglll和Sall将pEGFP-N1质粒和测序正确的 T-PDGF-C质粒双 酶切，电泳、胶回收目的片段后，用T4 DNA连接酶连接得到 pEGFP-NI-PDGF-重组质粒，转化和质粒提取后，进行双酶切鉴 定，内

7、切酶为 Bglll 和 Sall 。 2 结果 2.1大鼠PDGF-C基因的克隆与测序 以SD大鼠肝脏组织获 得的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1廟脂糖凝胶电泳 后可见大小约1053bp的特异性条带（见图1）。PCR产物连入 PMD18-T载体进行测序，测序结果经 BioXM 2.6软件分析与 Gen Ba nk公布的大鼠PDGF-C基因序列完全相同。 2.2 pEGFP-N1-PDGF-C 重组质粒的鉴定 将 pEGFP-N1-PDGF-C重组质粒用BglII和SalI进行双酶切，结果 得到1053bp和4.7kb两个酶切片段（见图2），证明大鼠PDGF-C 基因重组到了真核表达载

8、体 pEGFP-N1中。 3 讨论 高血压、动脉粥样硬化等血管增殖性疾病严重危害着人类的 健康，并且其发病率呈逐年递增的趋势。 血管平滑肌细胞的增殖 和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节， 其病理学分子机制是 近年来血管增殖性疾病的研究热点，也是目前防治的难点 2 。 血小板衍生生长因子（PDGF是成纤维细胞、平滑肌细胞以及其 它间充质来源细胞的强有丝分裂原和化学驱动剂， 其过度表达与 心血管疾病的发生有密切的关系。 PDGF-C是最近发现的PDGF家族新成员，它在多种正常和病 理组织中表达，在血管中，PDGF-C主要表达于平滑肌细胞，提 示其可能参与血管增殖性疾病的发病机制。本研究从SD大鼠肝 脏组织成功克隆出了 PDGF-C基因开放阅读框序列，其测序结果 与 GenBank 公布的基因序列（ GenBank Accession No. NM_031317完全相同。将 PD