大孔树脂柱层析法提取蛹虫草废弃培养基中的虫草素

1、大孔树脂柱层析法提取蛹虫草废弃培养基中的虫草 素 Extraction of Cordycepin from Waste Medium of Cordyceps Militaris with Macroporous Resin Column Choromatography ZENG Yu， CHEN Zuohong* (College of Life Science， Hunan Normal University ， Changsha 410081， China ) Objective To extract and purify Cordycepin from waste medium of

2、 Cordyceps militaris. Methods The optimal conditions of hot water leaching were as follows70 C, 8 h, dried feed : water is 1 g : 20 mL. And cordycepin were separated with an optimal macroporous resin column choromatography system , i.e. , macroporous resin XAD16 , at pH of 9.0, and 50% of ethanol as

3、 an eluant. At last cordycepin was purified with polyamide column chromatography. Result Cordycepin was prepared with a purity greater than 98%. 蛹虫草Cordyceps militaris (L. ) Link又名北冬虫夏 草、北虫草，含有多种活性化合物，如虫草素、麦角固醇、甘露 醇等，因其容易栽培已成为冬虫夏草的替代品 12. 虫草素 ( cordycepin )是蛹虫草的主要活性成分， 具有抗肿瘤、 抗病毒、 抗真菌、 免疫调节等药理作用 34.

4、 目前，虫草素主要从蛹虫草 子实体中提取， 从而导致虫草素的生产成本极高 5. 栽培过蛹虫 草的固体培养基中含有丰富的菌丝体，其中含有大量的活性物 质，但这些固体培养基常作为废料处理，造成很大的浪费 67. 目前，大多数研究采用热水浸提法 8 、索氏提取法 9 、超 临界萃取法 10 以及超声波水提法 11 等提取虫草素，但从这 些方法得到的虫草素纯度不高， 或者投入成本大， 难以取得理想 结果.刘红锦 12 等对大孔树脂分离纯化蛹虫草中虫草素的工艺 进行了研究， 考查了 7种大孔吸附树脂对蛹虫草中虫草素吸附纯 化的效果，再以高效液相色谱(HPLC法测定样液中虫草素含 量，筛选出适宜的树脂 .

5、Ni He13 等采用一种新的柱层析提取方 法一一循环柱层析提取法(CCE提取法)，对蛹虫草固体培养基 中的虫草素进行提取， 进一步分离纯化这些提取物， 得到了纯度 为 98%以上的虫草素晶体 . 本文以蛹虫草废弃固体培养基为原料， 利用热水浸提法和大 孔树脂柱层析法分离虫草素， 再用聚酰胺树脂进行精制， 并优化 提取步骤，为后续的扩大试验和规模生产提供参考依据 . 1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器 虫草素标样购自 Sigma 公司，蛹虫草废弃固体培养基由湖南 益康生物高科技XX公司提供. 乙醇（分析级） ；甲醇（色谱级） ；超纯水；大孔树脂 XAD16， XAD4 XAD7HP XA

6、D1180（北京慧德易科技 XX公司），DM130 （青岛利航树脂材料 XX公司）；聚酰胺树脂（浙江台州路桥四 甲生化塑料厂） . Waters 600 高效液相色谱仪（ Waters 公司）； YWGC1 8 （ 4.0 mM 300 mm 10 a m）色谱柱（大连依利特 XX公司）. 湖南师范大学自然科学学报 第 36 卷第 3 期 曾 昱等：大孔树脂柱层析法提取蛹虫草废弃培养基中的虫 草素 1.2 方法 1.2.1 色谱条件 色谱柱：YWGC1;8流速：1 mL/min ;检测 波长：254 nm；进样量：20 a L;柱温：25 C;流动相：15% 甲醇；洗脱时间： 20 min.

7、所有的样品在进样之前须过 0.45 a m 滤膜. 1.2.2 标准曲线的制备 取虫草素母液（ 1 g/L ）适量，将其 分别配制成 0.005 ，0.025 ，0.05 ，0.1 ，0.25 ，0.5 g/L 共 6 个 梯度，在上述的色谱条件下进样 20 a L,以进样量X （ a g）与 峰面积Y建立线性回归方程. 1.2.3 热水浸提粗提虫草素 采用热水浸提法对蛹虫草废弃 固体培养基中的虫草素进行粗提.料液比（W/V，浸提时间和浸 提温度是影响虫草素提取的重要因素， 本实验设计了一个 3 因素 3 水平的正交试验，如表 1 所示 . 1.2.4 大孔树脂柱层析 分离纯化虫草素 选用XA

8、D4 XAD16 XAD7HP XAD1180和DM130 共 5 种树脂进行静态吸附和解吸附实验， 再对筛选出来的树脂进 行动态吸附实验，确定最佳洗脱pH 值和洗脱剂 . （ 1 ）大孔树脂的静态吸附和解吸附取 5 g 已预处理的大孔 树脂，置于锥形瓶中，分别加入 pH3.0，6.0 ，9.0，12.0 的培养 基浸提液50 mL,静态吸附24 h，期间定时振荡.HPLC检测滤液 中虫草素质量浓度 . 将上述处理的大孔树脂置于锥形瓶中，分别 加入对应pH的40%乙醇30 mL，静态解吸附24 h，期间定时振 荡.HPLC检测滤液中虫草素质量浓度.综合静态吸附和解吸附能 力，筛选出最合适的大孔

9、树脂 . （2）大孔树脂的动态吸附 取适量预处理后的大孔树脂装入 层析柱中，调节pH为3.0，6.0，9.0，12.0，浸提液上样前调 至相同的pH,用对应pH的蒸馏水洗脱，再用 50 mL对应pH的 30%， 40%， 50%， 60%的乙醇溶液（均为体积分数，下同）洗脱， 收集乙醇洗脱液，定容至 50 mL，HPLC检测洗脱液中虫草素质量 浓度，由此得到最佳的洗脱液浓度和洗脱pH值. 1.2.5 虫草素的分离 将预处理后的大孔树脂装入层析柱, 调至最佳pH,浸提液上样前调至最佳 pH.待吸附至层析柱2/3处 时停止上样；用45倍柱床体积的蒸馏水洗脱，再用乙醇溶液 洗脱,分级收集洗脱液 .

10、活化GF254硅胶板，用虫草素标样与洗脱液点板，在展开剂 为V氯仿：V甲醇=2： 1 (每10 mL加2滴氨水)的体系中展 开，置于 254 nm 紫外灯下显色，合并含虫草素的洗脱液 . 浓缩洗脱液， 加入 4 倍体积的无水乙醇， 充分反应后除去沉 淀，浓缩置于4 C冰箱中数日，直至析出晶体.用蒸馏水重结晶 多次，直至晶体变为纯白 . 1.2.6 虫草素的精制 将预处理后的聚酰胺树脂装入层析 柱，用蒸馏水溶解虫草素晶体，上样，用23倍柱床体积的蒸 馏水洗脱，收集洗脱液，浓缩后置于冷冻干燥机内干燥，-20 C 冰箱内保存 . 2 结果与讨论 2.1 回归线性方程 虫草素的标准曲线为 y=3 31

11、2 350.30 x+243 414.61(R2 =1.00 )，线性范围为0.110 U g,在此范围内，线性关系良 好. 在选定的色谱条件下，虫草素的出峰时间为18 min 左右. 2.2 优化的热水浸提条件 作者设计了一个 3 因素 3 水平正交实验优化热水浸提条件， 结果如表 1 所示 . 表 1 正交试验结果 Tab.1 L9 ( 3) 3 experimental results 编号 A B C 浸提温度/ C浸提时间/h料液比/ (g?mL-1) 虫草素质量浓度 / g?L-1 ) 70 8 1 :10 0.056 70 10 1 :15 0.042 70 12 1 : 20

12、0.040 80 8 1 : 20 0.033 80 10 1 : 10 0 .024 80 12 1 : 15 0.031 90 8 1 : 15 0.022 90 10 1 : 20 0.026 90 12 1 : 10 0.010 各因素不同试验水平对虫草素质量浓度的影响如表2 所示. 表 2 各因素不同试验水平对虫草素提取的影响 Tab.2 Extraction of cordycepin under different conditions 水平 虫草素质量浓度 / （g?L-1 ） A （浸提温度）B （浸提时间）C （料液比） K1 0.137 0.110 0.090 K2 0.

13、088 0.091 0.095 K3 0.058 0.082 0.099 k1 0.046 0.037 0.030 k2 0.029 0.030 0.032 k3 0.019 0.027 0.033 R 0.027 0.009 0.003 最佳水平 A1 B1 C3 KAi=艺 Ai 虫草素质量浓度；kAi=KAi/3 ； R=max( kAi ) -min ( kAi ) . 根据虫草素的质量浓度， 作者选出了浸提实验的最佳条件组 合，即浸提温度70 C,浸提时间8 h，料液比1 g : 20 mL. 2.3 虫草素的分离 根据 5 种大孔树脂对虫草素的吸附和解吸附能力对其进行 了筛选，结果

14、如图 1 及图 2 所示，可以看出，XAD1 6吸附后滤 液中虫草素质量浓度最低， 解吸附后滤液中虫草素质量浓度最 高，因此XAD16对虫草素静态吸附能力和解吸附能力最好.不同 pH条件下各树脂的吸附和解吸附效果不同，对于XAD16 pH 为9和12时效果最好. 图 1 大孔树脂对虫草素的吸附能力 Fig.1 Adsorption of cordycepin on different macroporous resins 图 2 大孔树脂对虫草素的解吸附能力 Fig.2 Desorption of cordycepin on different macroporous resins 应用XAD

15、16进行动态洗脱时，不同浓度的乙醇在不同 pH下 的洗脱效果如图 3. 可以看出，当乙醇体积分数为 50%和 60%， pH 为 9.0 和 12.0 时，洗脱效果最明显 .综合以上的结果， 作者最终选择XAD16树脂作为填料，50%乙醇作为洗脱剂，pH为 9.0 的柱层析体系对虫草素进行分离 . 2.4虫草素晶体的HPLC检测 按照优化的实验条件对虫草素进行提取和纯化， 得到了纯白 色晶体产物.HPLC检测虫草素水溶液，纯度达到了 98%以上，见 图 4. 图 3 XAD 1 6动态实验 Fig.3 Elution of cordycepin by XAD16macroporous resin 图4晶体的HPLC分析 Fig.4 HPLC analysis of cordycepin crystal 3 结论 本实验以废弃的蛹虫草固体培养基为提取材料，