多聚酶链式反应扩增DNA片段(经典版)

1、1 课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段 2 DNA指纹法在案件侦破中有重指纹法在案件侦破中有重 要作用，刑侦人员通过案发现要作用，刑侦人员通过案发现 场的血液、头发等样品中提取场的血液、头发等样品中提取 的的DNA，与犯罪嫌疑人的，与犯罪嫌疑人的 DNA进行比较，就由可能为案进行比较，就由可能为案 件的侦破提供证据。件的侦破提供证据。 讨论：讨论： 1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人 员要怎样才能得到足够量的员要怎样才能得到足够量的DNA呢？呢？ 2.你还能说出你还能说出DNA鉴定技术在其他

2、方面的应用吗？鉴定技术在其他方面的应用吗？ 3 4 5 6 A T G C A G C T 5 端端 3 端端 5端端 3端端 识别识别 ： -OH端为端为3; 磷酸基团的磷酸基团的 末端为末端为5。 7 8 9 10 11 12 解旋酶解旋酶 DNADNA母链母链 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶 引物（引物（ RNA） 打开打开DNADNA双链双链 模板模板 合成子链的原料合成子链的原料 催化子链合成催化子链合成 使使DNADNA聚合酶能从聚合酶能从 引物引物3 3端开始连接端开始连接 脱氧核苷酸脱氧核苷酸 思考：思考：体外扩增体外扩增DNADNA时，如何提供与体时

3、，如何提供与体 内内DNA复制相似条件？复制相似条件？ 变性（变性（ 80100 ） Taq DNA聚合酶聚合酶 （耐高温）（耐高温） 2030个核苷酸构个核苷酸构 成成DNA或或RNA 13 DNA双链双链 变性（加热变性（加热80-100 ） 复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却） DNA单链单链 变性的目的：变性的目的：解开双链解开双链 复性的目的：复性的目的：有利于引物有利于引物1和引物和引物2与两条单链与两条单链 的结合的结合 14 PCR扩增仪实际上就是一台能够扩增仪实际上就是一台能够自动调自动调 控温度控温度的仪器，它可以根据的仪器，它可以根据DNA的热变的热变 性原理性原理，通过自动

4、改变温度，达到扩增，通过自动改变温度，达到扩增 DNA片段的目的。片段的目的。 15 12345 22 55 72 94 时间（时间（minmin） 温度 （） 适温延伸适温延伸 高温变性高温变性 低温复性低温复性 重复重复1 13 3步步3030轮轮 DNA复制的方向： DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端端延伸延伸 变性变性 复性（退火）复性（退火） 延伸延伸 16 二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/ 3/ 3/5/ 5/ 3/ 引物引物 5/3/ 引物引物 变性变性95oC 复性复性 55oC 延伸延伸 72oC 5/ 3/ 3/5/ 17 5 引物引物

5、1 5 引物引物2 第二次复制第二次复制 第一次复制第一次复制 5 5 5 5 5 5 模板模板DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 18 三、三、 PCR实验操作实验操作 19 20 一种通过高速转动产生离心现象，能将一种通过高速转动产生离心现象，能将 固体与液体分开的设备。固体与液体分开的设备。 21 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备） （2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液） （3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混

6、合混合） （4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心） （5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应） 22 四、四、 结果分析与评价结果分析与评价 DNA 含量的测定：含量的测定：稀释稀释 对照调零对照调零 测定测定 计算计算 5050倍倍 蒸馏水做蒸馏水做 对照对照 波长波长260nm 处读数处读数 23 24 25 测定并测定并 26 的含量为的含量为 紫外分光光度计紫外分光光度计比色杯比色杯 27 体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别： 体内复制体内复制PCRPCR技术技术 解旋解旋

7、在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细 胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开 加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全 部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶 引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段 DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶 （不耐高温）（不耐高温） TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋 边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。 半保留复制，完全解半保留复制，完全解 旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链 的一端开始复制。的一端开始复制。 复制的方向复制的方向 子

8、链的子链的55端向端向 3 3端端 延伸延伸 子链的子链的55端向端向 3 3 端延伸端延伸 28 课堂小结课堂小结 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段 PCR原理原理 DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物 DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响 PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸 操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管 放入放入PCR设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增 测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算 29 练习巩固：练习巩固： 1.做做PCRPCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水 使用前必须进行的关键步骤是使用前必须进行的关键步骤是 A.A.反复洗涤反复洗涤 B.B.不怕外源不怕外源DNADNA污染污染 C.C.高压灭菌高压灭菌 D.D.在在-20-20储存储存 2.PCR2