内毒素的测定文档

1、内毒素概述 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结 构中的脂多糖（构中的脂多糖（LPS），这些成分只），这些成分只 在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或 活菌以发泡形式将其释出。活菌以发泡形式将其释出。 外层外层 菌体多糖（菌体多糖（O抗抗 原），与细菌侵原），与细菌侵 袭力有关。袭力有关。 中层中层 同一种属之间是相同一种属之间是相 同的。同的。 内层内层 特殊的糖磷脂，起特殊的糖磷脂，起 毒性作用，而无种毒性作用，而无种 属特异性。属特异性。 特异性多糖特异性多糖核心多糖核心多糖类脂类脂A 内毒素的结构 发热反应发热反应 1 激活血管活性物

2、质的释放激活血管活性物质的释放 2 激活凝血和纤溶系统激活凝血和纤溶系统 3 内毒素的生物学活性 直接或间接损害肝脏直接或间接损害肝脏 5 激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统 6 内毒素的生物学活性 激活补体激活补体 4 内毒素的有益作用 增加机体非特异性免疫力增加机体非特异性免疫力 1 防御放射性损伤，促进粒细胞生成防御放射性损伤，促进粒细胞生成 2 增加网状内皮系统功能增加网状内皮系统功能 3 抗肿瘤，免疫佐剂作用抗肿瘤，免疫佐剂作用 4 内源性内源性 内毒素血症内毒素血症 外源性外源性 内毒素血症产生原因 肠道内毒素的吸收肠道内毒素的吸收1 败血症时血中

3、细菌的释放败血症时血中细菌的释放2 3有效的抗菌治疗后，细菌崩解有效的抗菌治疗后，细菌崩解 输入了含有输入了含有 细菌的药物、细菌的药物、 血液或者体血液或者体 液等。液等。 内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素 的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化， 出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神 经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、 缺氧及酸中毒等。缺氧及酸中毒等。 内毒素血症的临床症状 最严重的后果

4、：致最严重的后果：致 死性感染性休克，死性感染性休克， 多器官功能衰竭，多器官功能衰竭， DIC等。病死率极等。病死率极 高。高。 肺炎肺炎100%、尿路感染、尿路感染70-80%、腹腔感、腹腔感 染染72-84%、烧伤、烧伤85%、急性胰腺炎、急性胰腺炎90%、败、败 血症血症70%、急性肝炎、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎、暴发性肝炎 58-100%、丙肝、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻、胆石症伴急性梗阻 性化脓性感染性化脓性感染85%、多器官功能衰竭、多器官功能衰竭100%。 各类疾病内毒素血症的发生率 内毒素检测的临床应用 在肝胆疾病中的应用在肝胆疾病中的应用1 在呼吸系统感染中

5、的应用在呼吸系统感染中的应用2 在胰腺疾病中的应用在胰腺疾病中的应用3 在溃疡性结肠炎中的应用在溃疡性结肠炎中的应用4 在全身性细菌感染中的应用在全身性细菌感染中的应用5 在不明原因发热中的应用在不明原因发热中的应用6 内毒素检测在医院中的应用 在医院灭菌制剂检验中应用在医院灭菌制剂检验中应用1 对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测2 在透析站和血站中的应用在透析站和血站中的应用3 在临床医学研究中的应用在临床医学研究中的应用4 内毒素的检测方法内毒素的检测方法 背面观背面观 就像是古代武士的心甲就像是古代武士的心甲 腹面观腹面观 腹部基本呈六角形，腹部

6、基本呈六角形， 还可以看到它发达的附肢还可以看到它发达的附肢 内毒素的检测原理内毒素的检测原理 p革兰阴性菌脂多糖（内毒素）检测原 理：革兰阴性菌脂多糖（内毒素）激 活酶反应主剂中的相应因子后形成凝 固蛋白， 根据其引起的浊度变化对革 兰氏阴性菌脂多糖（内毒素）浓度进 行定量测定。 内毒素的检测原理内毒素的检测原理 G G 内毒素的检测方法内毒素的检测方法 鲎试剂（鲎试剂（Limulus amebocyte lysate LAL) 凝胶法凝胶法0.03EU/ml范围内半定量范围内半定量 1 浊度法浊度法0.006-300EU/ml,检测范围大检测范围大 2 比色法比色法0.006-15EU/m

7、l范围内定量范围内定量 3 ELISA0.1pg/ml 4 流式细胞术流式细胞术测内毒素的量而不是活性测内毒素的量而不是活性 5 化学发光测定法化学发光测定法6 内毒素检测的参考值 p检测值检测值10pg/ml,阴性。阴性。 p检测值介于检测值介于1020pg/ml之间，临床观察期，之间，临床观察期， 建议动态采血检测。建议动态采血检测。 p检测值检测值20pg/ml，阳性，建议再次采血以确诊，阳性，建议再次采血以确诊 。 肝炎肝炎 败血症败血症 肿瘤肿瘤 内毒素浓度内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700 检测样本的采集及影响因素 检测样本：血液 采集要求：采样过程要求无菌操作

8、，用专用的无热原真空采 血管。常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患 者透析前采血）。 样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及 时检测，应将血浆转移至无热原转移管内，在-30冰箱 中冷冻保存，一周内使用。 特殊标本处理 ：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释25 倍后进行检测 ；对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本， 应重新采血。 影响结果的因素 p产生假阳性的原因有：操作环境及操作过 程中污染，应用某些抗生素类如-酰胺内酯 类、喹喏酮类等患者。 MB-80微生物快速动态检测系统 (1-3)- -D-葡聚糖葡聚糖 p 1.1.内源性诱因内源性诱因 2.2.外源性诱因外源性诱因

9、 影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、 肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等 刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402 临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期 中国感染与化疗杂志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期 l 尸检研究发现，尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊 l 诊断困难的主要原因诊断困难的主要原因： - 临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖 - 确诊常需侵入性手段获得组织标本

10、，侵入性操作常因患者确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者 的病情所限难以实施的病情所限难以实施 - 真菌检测项目开展相对不足或滞后真菌检测项目开展相对不足或滞后 IFIIFI诊断困难及漏诊情况严重诊断困难及漏诊情况严重 肺炎肺炎 肺纤维肺纤维 症症 脑出血脑出血 脑梗塞脑梗塞 硬膜下血硬膜下血 瘤术后瘤术后 胸部大动胸部大动 脉瘤术后脉瘤术后 糖尿病糖尿病 再生障碍再生障碍 性贫血性贫血 MODS DIC 胃癌，肝胃癌，肝 癌，肝内癌，肝内 胆管癌，胆管癌， 肺癌，多肺癌，多 发性骨髓发性骨髓 瘤，白血瘤，白血 病，恶性病，恶性 淋巴瘤淋巴瘤 肺结核肺结核 腹腔内脓腹腔内脓 肿肿

11、 AIDS 侵袭性真菌感染侵袭性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的发病的发病 率率逐年上升逐年上升,其中又以其中又以侵袭性肺部真菌感染侵袭性肺部真菌感染( invasive pulmonary fungal infection, IPF I) 最常见最常见,大约占大约占50% 60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可病死率可 高达高达30% 80% 。 侵袭性肺部真菌感染侵袭性肺部真菌感染 l临床表现临床表现：缺乏特异性缺乏特异性, ,多表现为发热、咳多表现为发热、咳 嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。嗽、咳痰

12、、咯血、胸闷、呼吸困难等。 l 现现 状状：两高两低一快两高两低一快 检测方法相对滞后检测方法相对滞后, ,早期诊断和治疗仍存在困难早期诊断和治疗仍存在困难, ,副作用小的副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵新型抗真菌药物价格昂贵, ,导致病死率高。导致病死率高。 高院内感染率和病死率高院内感染率和病死率 低临床和实验室诊断率低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快患者病情恶化快 侵袭性肺部真菌感染侵袭性肺部真菌感染 Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:36403645. Garey KW et al. Clin Infect

13、Dis 2006, 43:2531 . 1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层 几丁质 麦角固 醇 1,3葡聚糖 合成酶 mannoproteins 1,3 真菌细胞膜、壁结构真菌细胞膜、壁结构 羊毛固醇羊毛固醇C C1414去甲基化酶去甲基化酶 1414位还原和位还原和7 78 8位异构酶位异构酶 角鲨烯环氧化酶角鲨烯环氧化酶 真菌细胞壁成分，占真菌细胞壁成分，占50%以上以上1 其他微生物、动物及人的细胞不含该成分其他微生物、动物及人的细胞不含该成分2 用于侵袭性真菌感染的早期诊断用于侵袭性真菌感染的早期诊断3 1.2.3. 。 “G”试验缘何而来？试验缘何而来？ 内毒素与-葡聚糖的检测比较葡聚

14、糖的检测比较 已知能与鲎试剂发生反应的物质有已知能与鲎试剂发生反应的物质有 细菌内毒素和细菌内毒素和-葡聚糖，但它们的葡聚糖，但它们的 反应曲线不一样。内毒素反应曲线反应曲线不一样。内毒素反应曲线 为为S型特征曲线，而型特征曲线，而-葡聚糖反应葡聚糖反应 曲线为经过曲线为经过0点的斜线。点的斜线。 内毒素和内毒素和- -葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线 观察期不确定，费时费力，特观察期不确定，费时费力，特 征性不明显并对医师的专业水征性不明显并对医师的专业水 平要求高平要求高 辅助方法：临床表现，免疫学，病辅助方法：临床表现，免疫学，病 理学，影像学检查等理学，影像学检

15、查等 用于实验室检测，已成为这一用于实验室检测，已成为这一 领域研究的热点领域研究的热点 3.PCR3.PCR技术：技术：真菌的抗原、抗体及代真菌的抗原、抗体及代 谢产物的血清学检查和真菌核酸检谢产物的血清学检查和真菌核酸检 测测 对儿童及接受造血干细胞移植对儿童及接受造血干细胞移植 患者、患者、ICUICU患者不适用患者不适用 2.GM2.GM试验：试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗曲霉属半乳甘露聚糖抗 原检测。判断是否曲霉属真菌感染原检测。判断是否曲霉属真菌感染 耗时短，灵敏度高，特异性强，耗时短，灵敏度高，特异性强， 定量检测可判断感染严重程度定量检测可判断感染严重程度 1.G1.G试验：试验：

16、通过检测通过检测(1-3)-D-(1-3)-D-葡葡 聚糖的含量，判断是否有真菌感染聚糖的含量，判断是否有真菌感染 非传非传 统统 检查检查 敏感性低，耗时长敏感性低，耗时长, , 培养阳性培养阳性 率低。培养结果是定性的，有率低。培养结果是定性的，有 些标本采集困难些标本采集困难 直接培养真菌法直接培养真菌法 传传 统统 检检 查查 科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色： p热带念珠菌-灰蓝色 p白色念珠菌 -绿色 p克柔念珠菌-粉红色 p光滑念珠菌-紫红色 p其他念珠菌-白色 科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色： A/E-白色假丝酵母菌，白色假丝酵母菌，B/C-克柔假丝酵母菌，克柔假丝酵母菌，F

17、-光滑假丝酵母菌，光滑假丝酵母菌，D-热带假丝酵母菌热带假丝酵母菌 -D-D-葡聚糖的评价葡聚糖的评价 l敏感性、特异性：敏感性、特异性：9090左右左右 J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013. BG值在值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值临床表现出现之前就已经高于正常值 u Pazos等报道等报道5例确诊例确诊IFI及及3例临床诊断的例临床诊断的IFI患者，发现患者，发现 BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部HRCT检检 查发现以前查发现以前 。 平均早于发热平均早于发热5 d 早于呼吸道症状平均早于呼

18、吸道症状平均10.7 d J Clin Microbiol，2005，43(1)：299305 u Odabasi等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为 期期3周每周周每周2次采血检测及临床观察次采血检测及临床观察 发现：发现：BG值开始高于值开始高于60 pgml的时间比最后的时间比最后 确诊为确诊为IFI或临床诊断或临床诊断IFI平均提前了平均提前了10 d Clin Infect Dis，2004，39(2)：199205 -D-D-葡聚糖参考值葡聚糖参考值 p检测值检测值10pg/ml,阴性。阴性。 p检测值介于检测值介于1020pg/ml之间，临床之间，临床 观

19、察期，建议动态采血检测。观察期，建议动态采血检测。 p检测值检测值20pg/ml，阳性，阳性(深部真菌感深部真菌感 染染)，建议再次采血以确诊。，建议再次采血以确诊。 关于关于G G试验试验建议建议 G试验临床应用试验临床应用 1明确诊断明确诊断 （抗真菌药物治疗前）（抗真菌药物治疗前） 2治疗效果监测治疗效果监测 （抗真菌药物治疗后）（抗真菌药物治疗后） 3连续连续2次采血进行次采血进行G试验试验 标本采集及保存 临床临床细菌内毒素及细菌内毒素及 (1-3)-(1-3)- -D-Glucan-D-Glucan检测的国内外发展检测的国内外发展 p国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液

20、、国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、 唾液、乳汁等）中内毒素以及唾液、乳汁等）中内毒素以及(1-3)-(1-3)- -D-Glucan-D-Glucan微量定量微量定量 检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用 细菌内毒素及细菌内毒素及(1-3)-(1-3)- -D-Glucan-D-Glucan检测仪器及配套的检测试检测仪器及配套的检测试 剂盒剂盒，而且获得而且获得FDAFDA及厚生省批准文号，作为一种日常检及厚生省批准文号，作为一种日常检 测项目。测项目。 p国内：国内：MB-80 检测系统，为国内独家研制和生产的

21、检测检测系统，为国内独家研制和生产的检测 临床临床内毒素及内毒素及(1-3)-(1-3)- -D-Glucan-D-Glucan的专用仪器，同时具有配的专用仪器，同时具有配 套的检测试剂盒套的检测试剂盒 EKT-5Mset and GKT-%M set获得获得SDASDA 批准文号批准文号, , 发热反应发热反应 1 激活血管活性物质的释放激活血管活性物质的释放 2 激活凝血和纤溶系统激活凝血和纤溶系统 3 内毒素的生物学活性 内毒素的检测方法内毒素的检测方法 1.1.内源性诱因内源性诱因 2.2.外源性诱因外源性诱因 影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、 肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等 刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402 临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期 侵袭性真菌感染侵袭性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的发病的发病 率率逐年上升逐年上升,其中又以其中又以侵袭性肺部真菌感染侵袭性肺部真菌感染( invasive pulmonary fungal