细菌内毒素检验操作程序(20201208072339)

1、山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243-B页码：1/9制定人：审核人：批准人：颁发部门：日期：日期：日期：生效日期：分发部门：品质部、中心化验室、过程分析室目的：规范细菌内毒素检验操作程序。范围：适用于细菌内毒素检查操作。责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。内容1准备工作实验设备及用具1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）、药匙、250C烘烤1小时。1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管 内毒素标准品与实验试剂1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵

2、敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量v mL灭菌注射用水）。1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品。75%乙醇、铬酸洗液。实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250r干热灭菌至少60分钟。恒温水浴箱内水浴温度调节到 37 1 r。2鲎试剂灵敏度复核根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：入=EU/ml），细菌内毒素工作标准品加入1ml细菌内 毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。将工作标准品制备成 2入、入、入、入四个浓度（EU/ml、EU/ml、EU/ml、EU/ml）

3、 的内毒素标准溶液，备用。16EU/ ml160EU/ ml* 8EU/ ml 1EU/ ml* mlml山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：2/9例：工作标准品为160 EU/ml时注意：每稀释一步均应在混合器上混匀 30秒。取18支EU/ml鲎试剂，每支中加入 水，然后分别加入中制备好的4个浓度的标准液, 按浓度从高到低依次加入，每个浓度加 4支，；最后2支加入 水作阴性对照。将上述试管用医用胶布封口，垂直放入 37C 1C水浴锅中，保温60 2分钟。放入水 浴前把水搅动几下，以使水温均匀。再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和取 放过

4、程应避免受到振动造成的假阴性结果。保温结束后将试管轻轻取出，缓缓转到 180,若关内形成凝胶，不变形、不从管壁滑 落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性。 （注意：保温盒拿取试管 过程应避免受到震动而造成的假阴性结果）结果判定当最大浓度2入4支管均为阳性，最低浓度入4支管均为阴性，阴性对照2支管为阴 性，实验方有效。如图1山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：3/92入 X 0.5X a25X 0000000000000000按下述公式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值入c当入c在入-2入时，方可用于细菌内毒素的

5、检查，并以标示灵敏度入为该批鲎试剂 的灵敏度。入 c= antilg（艺式中：X为反应终点浓度的对数值lg。反应重点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后 一个呈阳性结果的浓度。antilg 是lg函数的反函数，在excel里可以用power公式, power （数值）举例设待复核鲎试剂的灵敏度为 EU/ml，即入=EU/ml。实验结果如下：内毒素浓度（EU/ml）Nc反应终点浓度X1+ -2+-3+4+山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：4/9则：入 c =antilg（ 刀X/4）=antilg（ + + + ） /4=antilg antil

6、g=（ EU/ml）入c在入-2入范围内，符合规定。结果不是内毒素最大浓度（2入）4管全部阳性，最小浓度（入）4管全部阴性，本批鲎 试剂不能使用。需查找原因，可能是灵敏度标示不准确或内毒素效价标示不准确，或操 作不当所致。3.干扰实验干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反 应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成 4个浓度的标准溶液即 入、入、 入、入。制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即入、

7、入、入、入 的含内毒素的供试品溶液。鲎试剂的准备取规格为支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酉精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入检查用水溶解，轻轻转动瓶壁， 使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是支时，按其标示量加入 检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每分装到10X 75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。凝胶反应山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：5/9将准备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。 其中的4支4列每列每

8、支分别加入的 入、入、入、入 的内毒素标准对照液，另一列 2 支（管）加入检查用水作为阴性对照。将另外 18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5 列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入的 入、入、入、 入的内毒素的含供试品溶液；另一列 2支（管）加入供试品溶液作为样品阴性对照，如 表1所示。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，两同试管架放 入37C 1C水浴或适宜恒温器中，保温 602分钟后，观察并记录结果。表I凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/ 被加入内毒 素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素 的浓度平行管数A无/供试品溶 液2B2入/供试品供

9、试品溶液12入4溶液21 X44X48X4C2入/检杳用 水检杳用水12X421 X44X48X4D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对 照。山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：6/9判定并计算C和B的反应终点浓度的集合平均值（Es和Et）只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C的结果 在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液 C和B的反应终 点浓度的几何平均值（Es和Et ）:Es= an tilg（刀 Xs / 4 ）Et=a ntilg（

10、刀 Xt / 4 ）式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg ）。当Es在入2X（包括 入和2入）及Et在2 Es （包括和2 Es ）时，认为供试品 在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供 试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加 热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去 活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检

11、查法时，须进 行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果 的变化时，须重新进行干扰试验。3供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验要求：在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做 2支供试品和2支供试品阳性对照，同 时每次试验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。4.1.1因药典对甘露醇原料药内毒素无要求，参照甘露醇注射液内毒素限值，每1g甘露醇中含内毒素的量应小于。根据MVD=CL/，且当供试品为注射用原料药时， MVE取1。故20%甘露醇注射液的鲎试剂限度为：入=ml X g=ml操作方法421供试品溶液的制备山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号

12、：SOP-QM-243- B页码：7/9准确称取甘露醇用ImIBET水溶解，制成20%甘露醇溶液。根据MVD=CL/，将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过 MVD 式中：C为供试品浓度。L为供试品的细菌内毒素限值。入为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度。例：当用标示值为 ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CLA=20%X =1（倍），所以把供试品制 成20%的稀释液即可。 当用标示值为ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CLA=20%X =2（倍）,所以把供试品制 成10%的稀释液即可。 当用标示值为ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CLA=20%X =4（倍）,所以把供试品制 成5%的稀释液即可。阳性对照溶液的

13、制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成 2入浓度的内毒素标准溶液。取规格为10EU的细菌内毒素标准品一支用酒精棉球将瓶颈消毒后开启，加BET检查用 水混合15分钟后备用。例：当用标示值为ml灵敏度的鲎试剂时，2入=ml，（10EU/ml标准品溶液）ml标准品溶液）1. 0EU/ mlml10EU/ ml标准品溶液例：当用标示值为ml灵敏度的鲎试剂时，2入=ml，（10EU/ml标准品溶液）ml标准品溶液）ml标准品溶液）10EU/ ml*1. 0EU/ ml*mlml山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：8/9供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试

14、品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2入浓度的内毒素溶液例：当用标示值为ml灵敏度的鲎试剂时，2入=ml.（10EU/ml标准品溶液）10EU/ ml标准品溶液（20%试品溶液）ml标准品溶液）ml供试品阳性对照溶液1. 0EU/ ml 1（ 20%试品溶液）例：当用标示值为ml灵敏度的鲎试剂时，2入=ml,（10EU/ml标准品溶液）ml标准品溶液） ml标准品溶液）10EU/ ml*1. 0EU/ ml* ml EU/ml 供试品（10%供试品溶液）（10%供试品溶液）（10%共试品溶液）标准品溶液阴性对照液即细菌内毒素检查用水4.5.1鲎试剂的准备取规格为的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶

15、底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入检查用水溶解。4.5.2加样取8支2.2.5溶解好的鲎试剂，其中2支加入供试品溶液，作为供试品管；2支加入阳 性对照溶液，作为阳性对照管（PC）; 2支加入供试品阳性对照溶液，作为供试品阳性对 照管（PPC; 2支加入检查用水作为阴性对照管（NC。试验加样如：（单位ml）、参照管试剂、供试品管阳性对照PC供试品阳性对照PPC阴性对照NC12121212鲎试剂山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码9/9供试品液BET用水供试品阳性对 照液阳性对照液4.5.3将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜