药物跨膜转运载体tor

1、药物跨膜转运载体tor 药物跨膜转运载体tor 一、 ABC类转运体 ATP结合盒(ATP-binding cassette， ABC)类物质外排转运载体。 这类转载体转运各种类型的底物如糖、氨 基酸、金属离子、多肽、蛋白质以及各种 脂溶性物质外排式跨膜转运。 ABC类载体是许多生命过程必须的，缺陷 可以引起多种疾病或与多种疾病有关如囊 性纤维化、神经系统疾病、视网膜变性、 胆固醇和胆汁转运缺失、贫血症和药物反 应异常等。 药物跨膜转运载体tor 特点： 1。与ATP结合，利用ATP跨膜转运物质。底物分子 转运是单向的，通常是泵出细胞外。 2。结构上：ATP-结合域, 称之为核苷结合包( NB

2、F) 和跨膜(TM)域。该域一般由6个-螺旋段组成。 NBF 含3个保守区域Walker A、Walker B和 Walker C。在Walker A和B存在ATP结合点，而 Walker C 为一签名区, 位于Walker B 的上游，C 区是相应ABC载体特有性的。 3。典型的ABC 载体有两个NBF 和两个TM域, NBF 存在于胞浆侧。 药物跨膜转运载体tor 发现48 个ABC 载体。 这些基因根据区域的构成和氨基酸的同 组关系分成7个亚型。 许多ABC载体在脂质层的功能维持、脂 肪酸转运和类固醇类转运方面有重要的 作用。 已发现14种与人类疾病相关的ABC基因 药物跨膜转运载体to

3、r ABCC2（Abcc2）基因突变：与Dubin- Johnson 综合征有关。 ABCC2 蛋白存 在于肝细胞的管侧面膜上调节有机阴离 子转运。在多有机阴离子转运载体 （TR-）的缺陷的大鼠中，该大鼠已用 作Dubin-Johnson 综合征的动物模型。 ABCB7基因的错义与成高铁红细胞贫血 症和失调（XLSA/A）相关。 药物跨膜转运载体tor CFTR 蛋白为氯离子通道，与所有外分泌有 关，缺陷导致胆囊纤维病变。 ABCC8 是磺酰脲受体，对磺酰脲药物有高 度的亲和力。磺酰脲类药物为治疗非胰岛 素依赖性糖尿病，主要促进胰岛素的分泌。 ABCC8基因突变可能type II 糖尿病有关

4、。 药物跨膜转运载体tor 二、多药耐药（药物外排载体） 所有ABC的外排在体均存在于细胞膜上， 参与各种结构类型的药物、代谢物和化合 物的外排。根据结构类型，药物外排载体 分为四大类 。 药物跨膜转运载体tor ABC家族药物转运载体的预测二级结构。NBD, （ATP）核苷结合点, IN, 细胞内,OUT 细胞外 药物跨膜转运载体tor 药物载体在极性细胞（包括组织内皮或上皮细胞）中的定位。 药物跨膜转运载体tor 1. MDR1 P-糖蛋白(MDR1 P-glycoprotein) ABCB1. 又称为MDR1，P-GP 或PGY1。 人 MDR1 MDR3 药物 药物，脂质 MDR基因

5、MDR基因 Mdr1a/mdr1b mdr2 药物 药物，脂质 药物跨膜转运载体tor P-GP 有两个相似和对称的半载体组成, 每个半载体有一个ATP结合点和6个TM 域。两个半载体只有43%氨基酸序列是 一致的。 药物跨膜转运载体tor 先与ATP结合，再水解是药物转运必需的。, 不同的底物转运需要的ATP分子是不同的， 每转运一个药物分子出细胞,需要0.3-3个分 子的ATP。 药物跨膜转运载体tor P-gp 催化循环催化循环. 药物和 ATP与Pgp 结合 药物跨膜转运载体tor P-GP转运柔红霉素(DNR) 跨膜两步过程。环孢素A (CsA), XR9576 (XR) 和长春碱

6、(VL)在细胞浆侧面阻断, 维拉帕米(VER) 在细胞外侧阻断(优先占领). 药物跨膜转运载体tor 2. P-GP 底物 P-GP有各种类型的底物如秋水仙碱阿霉素、 长春碱、脂质、类固醇、化学异物和多肽等. 似乎无共性 1）多数底物是两性分子 2)化合物脂溶性和氢键的数目决定底物与P- GP亲和力的重要参数。 脂溶性大或氢键数 目多，P-GP的亲和性高. 电子供体基团间距离有一定范围是识别P-GP 结合点必需的，至少其中一个2.5 0.3， 另一个为4.6 0.6 药物跨膜转运载体tor MDR1 P-GP 抑制剂 第一代P-GP抑制剂如维拉帕米、环孢素 A 第二代或第三代抑制剂 PSC 8

7、33, GF120918 药物跨膜转运载体tor P-GP生理功能 1) 肿瘤细胞 耐药原因之一 诱导性 2）正常体内：生理性屏障（肠上皮、脑 血管内皮细胞、胆小管上皮细胞、胎盘 合胞体滋养细胞） 药物跨膜转运载体tor 1) 血脑屏障 在脑血管内皮细胞腔侧面表达丰富 的P-GP, 成为许多药物难以通过血 脑屏障的原因; 药物跨膜转运载体tor 药物跨膜转运载体tor 药物跨膜转运载体tor 药物跨膜转运载体tor 一些疾病如癫痫诱导P-GP表达, 成为顽 固性癫痫的原因之一 炎症下调P-GP表达,导致血脑屏障的通透 性显著增加. 药物跨膜转运载体tor Fig. Western blot s

8、howed expression of P-gp from the cerebral cortex of normal rats and PTZ- kindled rats. n=3. (*p0.01 vs Normal) 药物跨膜转运载体tor Fig. P-gp functional activity in hippocampus and cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats. Samples of 60min after a single dose of 0.2mg/kg Rh123. n=4. (*p0.05, *p0.

9、01 vs Normal) 药物跨膜转运载体tor Fig . Distribution of PB in brain tissues of normal rats, kindled rats and kindled rats treated with CsA(5 mg/kg). Samples of 60min after a single dose of 10mg/kg PB. Data were expressed as ratio values as meanSD ( n=4). (*p0.05, *p0.01 vs normal rats, #p0.05, #p0.01 vs kin

10、dled rats). 药物跨膜转运载体tor 药物跨膜转运载体tor 2)在肝-胆和肠中作用 生物利用度的原 因 药物跨膜转运载体tor (1) 保护机制 防止毒物由胃肠道进入 体内。 (2）肠上皮细胞中P-GP分泌功能成为许 多药物吸收差的原因之一, 成为药物口 服吸收的障碍。 药物跨膜转运载体tor 野生型小鼠灌胃 50 mg/kg 紫衫醇约有95%的 药物原型从粪中排泄. 同时口服P-GP抑制剂环孢素A( 50 mg/kg), PSC 833(50 mg/kg), GF120918(25 mg/kg), LY335979(80mg/kg) 或R101933(80 mg/kg) , 显著

11、降低粪中原型药物的排谢分数， 分别为32.4%, 12.5%, 6.2%, 34.9%和73.6%。 在mdr1a/1b基因敲除小鼠，粪中原型排泄分 数只有6%。 药物跨膜转运载体tor 3) P-gP介导的药物外排,符合载体转运的特 点，存在饱和特性 某些底物的M-M常数 化合物 标本 表观Km（mol/l） 环孢素 Caco-2(净B-A) 3.8 地高辛 Caco-2(净B-A) 58 大鼠空肠片(净-向A) 81 大鼠回肠片(净-向A) 74 大鼠结肠片(净B-A) 51 人结肠片(净B-A) 59 依托甙 Caco-2(净B-A) 213 大鼠空肠片(净B-A) 94 大鼠结肠片(净

12、B-A) 119 维拉帕米 大鼠空肠片(净B-A) 31 大鼠回肠片(净B-A) 29 大鼠结肠片(净B-A) 4.4 长春碱 Caco-2(净B-A) 19， 27 大鼠回肠片(净B-A) 48 大鼠结肠片(净B-A) 100 药物跨膜转运载体tor 不同底物和剂量肠道P-GP的作用是不同的。 A. 地高辛通常剂量是0.5到1mg，肠内的浓度 不到10mol/l，低于Km 58 mol/l。P-Gp 在 吸收方面有重要的意义，可能是该药物吸收程 度地和变异大的主要原因。 B. 剂量大于50mg，肠内药物浓度达到mmol/l 水平， 可能超过相应药物的Km 值，P-GP的活 性处于饱和，P-G

13、P对药物吸收的贡献不大。 药物跨膜转运载体tor Indinavir：P-GP的底物，剂量高达 800mg，肠内浓度超过 1 mmol/L, 远远 大于Km 140 mol/L， p-GP的作用对贡 献不大。仍然有好的生物利用度 药物跨膜转运载体tor C.一些药物如环孢素（200700mg）、紫 杉醇（100200 mg），尽管剂量很高， 由于这些药物的溶解度和释放度低，肠 内的浓度低于Km值，但P-GP对吸收的影 响仍然很大。 D. 某些药物吸收程度随剂量增加而增加 如(S)-()-talinolol计量校正的AUC 由 12.5 mg 剂量的18 g .h/l 增加到 200 mg 剂量

14、的36g .h/l。 药物跨膜转运载体tor 4) 肠中P-GP也是机体重要保护机制 之一，免受各种肠中毒素的侵害。如 Mdr1a缺陷小鼠产生一种大肠炎症， 类似人类的肠内部炎。正常情况下， 肠中的P-GP 阻止毒素进入肠壁内. 复杂性和注意问题: 抑制胃肠道上P- GP功能, 必然降低屏障功能,增加毒物 (素)进入体内! 药物跨膜转运载体tor 肠不同部位P-GP的表达不同. 图6. 人肠中不同部位P-gp和villin IOD ratio比值平均 和变异.1/2代表十二指肠/近端空肠，3/4, 5/6, 和 7/8 分别代表中段至远端空肠，近端回肠支远端回肠。 药物跨膜转运载体tor 3)

15、 胎盘 屏障 P-GP 存在于胎盘合胞体滋养层顶侧面膜。类似于血脑 屏障，防止有毒物质从母体进入胎儿。 在P-GP缺陷或基因敲除动物，avermectin, 地高辛, saquinavir和紫杉醇通透性增加1020倍。 对于多数治疗药物而言，在胎盘上的低通透性当然是 需要的，但在有些情况下，成为治疗上的障碍。如对 于HIV治疗，希望在婴儿出生前，有一个合适的“负 荷剂量”，降低在出生过程中母-婴HIV感染的频率 药物跨膜转运载体tor 乳腺癌耐药蛋白(BCRP) 1.乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein ,BCRP, ABCG2）。 BCRP 只有一

16、个NBF 和TM域，为半ABC 载 体。 药物跨膜转运载体tor BCRP mRNA 最早发现于胎盘中。BCRP 首先是 从乳腺癌细胞中分离得到的，称之为乳腺癌耐 药蛋白。 第一次在耐阿霉素的MCF7乳腺癌细胞株(MCF- 7/AdrVp)中克隆到BCRP。鼠类命名为Bcrp1 BCRP 是细胞株对丝裂霉素、阿霉素和柔红霉 素抗癌药物等产生耐药的主要原因。 BCRP主要在细胞膜上，存在于细胞的顶侧面上. 药物跨膜转运载体tor 2. BCRP/Bcrp1 介导的耐药 BCRP 的底物与P-GP, MRP1和MRP2的底物间 有较大的重叠性 细胞株对丝裂霉素, 拓朴替康, 9-氨基喜树碱, 柔红

17、霉素, SN-38, flavopiridol, 吲哚咔唑, 拓 朴酶抑制剂( NB-506 和 J-107088) , 细胞染 料如罗丹明123, Lysotracker绿 , BBR3390以 及荧光素-BODIPY-prazosin. 对长春新碱, 紫杉醇和顺铂等抗癌药无耐药性 药物跨膜转运载体tor 不同药物诱导表达的结果往往存在差异。某些 药物诱导表达BCRP细胞株对蒽醌类有很高的 耐药性, 而另一些药物诱导BCRP表达的细胞株, 相对丝裂霉素而言，则对蒽醌类几乎没有耐药 性。 有些诱导表达BCRP细胞株对拓朴替康的耐药 性相当高, 但另一些诱导表达BCRP细胞株的耐 药很低 药物跨

18、膜转运载体tor 存在两种突变株： 野生型 482 位上的氨基酸为Arg 两种突变型:Thr和Gly。 不同的BCRP对底物的作用不同。 药物跨膜转运载体tor 野生型与突变型比较 野生型 突变型 482 位A Arg Thr或Gly 底物 叶酸及其衍生物 + - 罗丹明123 - + LysoTracker 绿 - + 柔红霉素 - + 丝裂霉素 + + bodipy-prazosin + + Hoechst 33342 + + 抑制剂新生霉素 + - 药物跨膜转运载体tor 3. BCRP/Bcrp1 抑制剂 （1）GF120918 ; P-GP 抑制剂，也是有效的 BCRP/Bcrp1

19、抑制剂; 抑制药物外排泵BCRP 和P-GP （2）fumitremorgin C (FTC), 是有效的 BCRP-抑制剂,但在体有神经毒性， 其中两种 类似物Ko132和 Ko134) 活性比FTC大，Ko134 细胞毒性很低，在体可以用很高剂量, 可以显 著增加小鼠口服拓扑替康的生物利用度 。 药物跨膜转运载体tor （3）某些HIV 蛋白酶抑制剂强效的 BCRP抑制剂.z在表达野生型BCRP的HEK 细胞株中，ritonavir,saquinavir 和 nelfinavir 是有效地抑制 BCRP介导的 丝裂霉素转运，其IC50 分别为19.5, 19.5 和 12.5 mol/l。

20、 药物跨膜转运载体tor （4）植物酚类化合物 ：5,7-二羟黄酮 (Chrysin) 和biochanin A ，silymarin, 橙皮素 （hesperetin）, 栎精（quercetin）, 黄豆苷 （daidzein）, stilbene resveratrol。 （5）香豆霉素抗生素：新生霉素 （6）酪氨酸激酶抑制剂 ：STI-571(imatinib mesylate), ZD1839 (Iressa; gefitinib) 和 N-4-(3-溴苯)胺-6-喹唑啉-2-丁胺 (EKI- 785) 药物跨膜转运载体tor 4. BCRP/Bcrp1 组织分布 在人的胎盘中，BC

21、RP mRNA 表达非常高， 而在鼠类胎盘相对弱。 相反，在小鼠的肾 脏表达最高，而在人的肾脏表达低表达。 BCRP 在胎盘合胞体滋养层膜的母体侧、在 肝细胞的胆管侧、肠的腔面侧膜，与MDR1 P-GP的定位相似。BCRP 也存在与乳腺的小 叶和排泄管的顶侧面。 药物跨膜转运载体tor BCRP 高表达于鼠原始造血干细胞中。分化的造血 干细胞系中，几乎不表达，但前红细胞和自然杀 伤淋巴细胞可以表达Bcrp1。 在人中，BCRP表达与鼠相类似，在干细胞中有较 高的表达，而在起源细胞表达降低，只有在自然 杀伤细胞和成红血球细胞表达，而在其他分化的 细胞中没有表达 BCRP 在脑血管内皮细胞高度表达

22、, 表达量高于 MDR和MRP1. 药物跨膜转运载体tor 3. BCRP/Bcrp1药理生理作用 1） BCRP分布与P-GP有重叠性 提示 BCRP/Bcrp1 的作用类似P-GP 。 药物跨膜转运载体tor 2）保护机制 阻止从胃肠吸收毒物吸收, 促进排泄 脱镁叶绿(甲酯-)酸 A（PHA）是叶绿素一种降 解产物，为一种光毒性成分。PHA在体内外排 转运是BCRP介导的，为ABCG2的特异性底物。 一项研究显示Bcrp1/ 小鼠对的PHA光毒敏感 性是的野生鼠100 倍以上，在敏感性增加的同 时，伴随随高的血药浓度。与正常食物比较， 喂养含PHA 或含20%紫花苜蓿食物后，血药浓 度分别

23、增加17和24倍，而野生鼠喂养任何食物， 血浆中PHA浓度都在检测浓度以下. 药物跨膜转运载体tor 3）血脑屏障的重要组成部分之一。 与野生型鼠比较, mdr1a缺陷小鼠和野生型小 鼠,长春碱脑摄取增加2倍,但哌唑嗪摄取不变 不影响,丝裂霉素的摄取反而有所降低。 合用 GF120918使哌唑嗪和丝裂霉素转运增加2.1和3 倍, 但GF120918不影响长春碱的转运。 在野生型鼠，PSC833增加长春碱的脑摄取, 但 不影响和丝裂霉素的摄取。合用GF120918使哌 唑嗪和丝裂霉素摄取分别增加1.5和2倍, GF120918也使长春碱的摄取增加。 abcg2 mRNA 主要在脑微血管中表达，约

24、是皮 层的700 倍。 药物跨膜转运载体tor （4）在骨髓细胞的 “傍细胞群” （side population， SP）中作用。 从骨髓中分离到一类细胞，这类细胞用Hoechst 33342 染色，结合双波长荧光显示浅红色和浅蓝色荧光，用 维拉帕米预处理，浅着色细胞消失。这类细胞称之为 傍细胞群。 ？ 浅着色提示细胞内Hoechst 33342浓度低，研究 显示在SP细胞中表有BCRP/Bcrp1，促进Hoechst 33342 外排所致. SP中富含未分化的干细胞，而在分化的干细胞系中 BCRP/Bcrp1表达低或缺乏。类似SP也出现在骨骼肌 和胚胎等其他组织干细胞, 伴随Bcrp1 的

25、高表达. BCRP/Bcrp1高表达可能是各种干细胞的一般特性. 药物跨膜转运载体tor 功能？ ABCG2 基因缺陷引起骨髓中和骨骼肌中SP细胞数降 低，用转染BCRP（-/-）骨髓细胞移植小鼠内导致细 胞再注入（repopulation）能力降低，造血细胞对丝 裂霉素敏感性增加 ,与正常小鼠比较，Mdr1a/1b 和 Bcrp1缺陷小鼠研究的各种造血功能正常，在SP几乎 消失.血祖先细胞对丝列霉素的敏感性增加。 用 Bcrp+/+ 和Bcrp-/- 小鼠祖先细胞研究显示，在 正常氧功能条件下，两种细胞的克隆数相同，但缺 氧条件下，Bcrp-/- 小鼠祖先细胞的克隆数下降。阻 断BCRP功能显著降低Bcrp+/+ 在缺氧条件下的生存 力 。 药物跨膜转运载体tor ABCG2 mNRA 在造血干细胞（SP, 34+/38-. 34+/KDD+细胞群）中表达高，而在定向分化 的祖细胞（34+/33+, 34+/10+）中表达显著 下降。在大多数成熟细胞中, 表达低, 但在自然 杀伤细胞和成红血球细胞表达高