医学生化核酸

1、核酸是构成生物体最基本最重要的物质之一核酸是构成生物体最基本最重要的物质之一, 存在于存在于 一切活细胞中一切活细胞中. 3.1 概述概述 一一. 核酸对生命的重要性核酸对生命的重要性 生物体正是由于遗传、变异的不断发生生物体正是由于遗传、变异的不断发生自然选择自然选择 由低级向高级发展由低级向高级发展 DNA RNA Pr 核酸是一类重要的生物大分子核酸是一类重要的生物大分子,担负着生命信息的存担负着生命信息的存 储与传递储与传递. 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域, 是基因工程操作的核心分子是基因工程操作的核心分子. 二二. 核酸的生

2、物学功能核酸的生物学功能 1868年年, 瑞士瑞士F.Miescher在脓细胞中发现含磷很高的酸性物在脓细胞中发现含磷很高的酸性物 质质,谓谓核素核素(nuclein) 1889年年, Altman制备了核酸制备了核酸(nucleic acid) 193040年年, Kossel & Levene等确定了核酸的组分等确定了核酸的组分 1944年年, Avery的肺炎双球菌转化实验的肺炎双球菌转化实验 or and 可分离可分离 1953年年, Watson & Crick DNA双螺旋模型双螺旋模型 1980年代年代, 核酶核酶(Ribozyme) DNA: 遗传信息的主要载体遗传信息的主要载

3、体, 负责遗传信息的贮存和发负责遗传信息的贮存和发 布布 RNA:少数病毒的遗传物质少数病毒的遗传物质 基因基因: DNA分子的一个片段分子的一个片段 “种瓜得瓜种瓜得瓜, 种豆得豆种豆得豆”“一个基因一条多肽链一个基因一条多肽链” 从从DNA转录遗传信息转录遗传信息, 并指导蛋白质生物合成并指导蛋白质生物合成 基因组基因组: 一个细胞的所有基因组合一个细胞的所有基因组合 1943年年,chargaff等证明了等证明了DNA中四种碱基的比例并不相等中四种碱基的比例并不相等 三三. 核酸的分类核酸的分类 核蛋白核蛋白 蛋白质蛋白质(组蛋白、精蛋白组蛋白、精蛋白, 碱性为多碱性为多) 核酸核酸 D

4、NA RNA DNA 真核真核 原核原核 病毒病毒 95%核中核中 (染色体染色体) 拟核拟核 DNA病毒病毒 核外核外 线粒体线粒体(mtDNA) 叶绿体叶绿体(ctDNA) 核外核外 质粒质粒(plasmid) tRNA 1015% mRNA 510% rRNA 7580% RNA 核核RNA 质质RNA 核仁核仁 线粒体线粒体 核蛋白体核蛋白体 胞液胞液 病毒病毒RNA 不均一不均一RNA(hnRNA) 核内小核内小RNA(snRNA) 染色体染色体RNA(chRNA) 线粒体线粒体RNA(mtRNA) 叶绿体叶绿体RNA(ctRNA) 四四. 核酸的组成核酸的组成 元素组成元素组成:

5、C、H、N、O、P P含量含量: RNA 9.4% DNA 9.9% 核酸核酸 核苷酸核苷酸 磷酸磷酸核苷核苷 碱基碱基戊糖戊糖 核糖核糖/脱氧核糖脱氧核糖 嘌呤碱嘌呤碱/嘧啶碱嘧啶碱 3.2 核苷酸核苷酸 一一. 戊糖戊糖 HH O HOH2C H OH H OH OH HH O HOH2C H OH H H OH HH O HOH2C H OH H OCH3 OH HH -D-核糖核糖-D-2-脱氧核糖脱氧核糖 -D-2-O-甲基核糖甲基核糖 CH3 OH HO D-核糖浓核糖浓HCl 绿色绿色 FeCl3 D-2-脱氧核糖脱氧核糖 蓝色蓝色 H NH + 地衣地衣酚反应酚反应 定性定量定

6、性定量 (675-680nm) 二苯胺二苯胺反应反应 定性定量定性定量 (595-620nm) 二二. 碱基碱基 嘧啶嘧啶 胞嘧啶胞嘧啶(C) (2=O,4-NH2 ) 尿嘧啶尿嘧啶(U) (2=O,4=O) 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T) (2=O,4=O,5-CH3) 嘌呤嘌呤 鸟嘌呤鸟嘌呤(G) (2-NH2,6=O )腺嘌呤腺嘌呤(A) (6-NH2) 碱基的性质碱基的性质 互变异构互变异构 C N N O O H H C N N OH HO U酮式酮式 U烯醇式烯醇式 紫外吸收紫外吸收 最大吸收峰在最大吸收峰在260nm附近附近 解离解离 C T U A G 稀有稀有(修饰修饰)碱基碱基 *

7、DNA 中含 中含U, RNA中含中含T 三三. 核苷核苷 戊糖戊糖+ +碱基碱基 - H2O 核苷核苷 戊糖戊糖(C1 )与与 嘧啶碱嘧啶碱N1 嘌呤碱嘌呤碱N9 连接成连接成 C1 N9 C1 N1 苷键苷键 O HOH2C H HH H OH OH N N N N NH2 9 1 腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷 胞嘧啶脱氧核苷胞嘧啶脱氧核苷 O HOH2C H HH H OH H N 1 N O NH2 1 * * 均为 均为-苷键苷键, 碱基与碱基与糖环平面基本垂直糖环平面基本垂直 O CH2 H H OH H OH H N N O NH2 HO syn-Cytidine O CH2 H H O

8、H H OH H N N NH2 HO anti-Cytidine O O CH2 H H OH H OH H HO syn-Adenosine N N N N NH2 O CH2 H H OH H OH H HO anti-Adenosine N N N N NH2 天然核苷一般天然核苷一般 为反式构象为反式构象 腺苷腺苷(A) 鸟苷鸟苷(G) 胞苷胞苷(C) 尿苷尿苷(U) 脱氧腺苷脱氧腺苷(dA) 脱氧鸟苷脱氧鸟苷(dG) 脱氧胞苷脱氧胞苷(dC) 脱氧胸苷脱氧胸苷(dT) 核核 苷苷 命名简写命名简写 修饰修饰(稀有稀有)核苷核苷 1)修饰碱基修饰碱基+糖糖 2)碱基碱基+修饰糖修饰糖

9、 N N N N N HCH3 dR N6-Methyl-dA HN N H O 5,6-dihydrouridine O R H H H (D or hU) N N CH3 NH2 5-Methyl-dC O dR O CH2 H H OH H OCH3 H HO 2-O-甲基腺苷 Ade (Am) 3)碱基碱基+糖糖(特殊方式连接特殊方式连接) O CH2 H H OH H OH H HO (pseudouridine) HNNH O O 5 1 假尿嘧啶核苷 () N N N N O R W(Y)核苷 N R H3C CH3 (Wyosine) HN N N C O R Q 核苷 (Qu

10、euosine) R H2N 碱基不是嘌呤碱基不是嘌呤 环环, 可以看作可以看作 鸟苷的衍生物鸟苷的衍生物 修饰核苷的缩写修饰核苷的缩写 少数修饰核苷用单字符表示少数修饰核苷用单字符表示, 如如D、I. 多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在 核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基. m N 2 2 取代位置 核苷 取代基的数目 取代基 甲基甲基m 乙酰基乙酰基ac 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羟基羟基o或或h 硫基硫基s 异戊烯基异戊烯基i 羧基羧基c 例例 HN NO R S

11、s4 U HN NO R O CH2OH om5 U或hm5 U 糖修饰的核苷糖修饰的核苷, 即糖分子中即糖分子中-OH的的H被取代被取代, 则在核苷符号的右边则在核苷符号的右边 加上取代基的小写字母加上取代基的小写字母 例例 2-O-甲基腺苷甲基腺苷, 写作写作Am Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP) Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP) 脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸 5 1 9 H H H HH H H H H 细胞内存在的细胞内存在的 是是5 -核苷酸核苷酸 命名命名: 碱基名碱基名-戊糖名戊糖名-

12、核苷酸核苷酸 或碱基苷酸或碱基苷酸 AMP GMP CMP UMP RNA dAMP dGMP dCMP dTMP DNA 核苷酸可进一步磷酸化生成核苷二磷酸及核苷三磷酸核苷酸可进一步磷酸化生成核苷二磷酸及核苷三磷酸 AMP - H2O H3PO4 ADP - H2O H3PO4 ATP 同样同样 GMPGDPGTP CMPCDPCTP UMPUDPUTP dAMPdADPdATP dGMPdGDPdGTP dCMPdCDPdCTP dTMPdTDPdTTP O-P O O- N N N N NH2 O H H OH H OH H OCH2O-P O O- O-P O O- 三磷酸腺苷 (AT

13、P) AMP ADP ATP 高能磷酸酯键高能磷酸酯键 7.3 kJ/mol 普通磷酸酯键普通磷酸酯键 2.0 kJ/mol AMPAMP进一步磷酸化生成进一步磷酸化生成ADPADP及及ATPATP cAMP(第二信使第二信使) cGMP 核苷酸也可环化形成环核苷酸核苷酸也可环化形成环核苷酸 性质性质 1.无色粉末或结晶无色粉末或结晶, 易溶于水易溶于水, 具旋光性具旋光性 2.具互变异构现象具互变异构现象 3.紫外吸收紫外吸收(最大吸收最大吸收260 nm) 4.两性解离和等电点两性解离和等电点 CMP的解离的解离 O CH2 H H OH H OH H O N NO NH2 P O O H

14、O CMP pKa2=4.5 - - O CH2 H H OH H OH H O N NO NH2 P O O O CMP pKa3=6.4 - - - - pI = CMP pKa1+pKa2 2 = 0.8+4.5 2 = 2.65 O CH2 H H OH H OH H O N NO NH2 P O O HO CMP pKa1=0.80 H + - O CH2 H H OH H OH H O N NO NH2 P O OH HO CMP + H+ 4 4种核苷酸的解离曲线种核苷酸的解离曲线 不能形成两性离子不能形成两性离子 (碱基碱性很弱碱基碱性很弱) 54% 5% 84% 可在可在pH

15、2.05.0之间分离各种核苷酸之间分离各种核苷酸 pH3.5时各核苷酸所带电荷时各核苷酸所带电荷 核苷酸核苷酸 磷酸基电荷磷酸基电荷 碱基的电荷碱基的电荷 净电荷净电荷 AMP-1+0.54-0.46 GMP-1+0.05-0.95 CMP-1+0.84-0.16 UMP-1+0-1 pH3.5时第一磷酸基几乎完全解离而带一个单位负电荷时第一磷酸基几乎完全解离而带一个单位负电荷, 第二磷酸基几乎不解离第二磷酸基几乎不解离, 而各含氮环的离子化程度不同而各含氮环的离子化程度不同, 故核苷酸所带的静电荷不同故核苷酸所带的静电荷不同, 电泳或层析即可彼此分离电泳或层析即可彼此分离. 2.3 核酸核酸

16、 一一. 结构结构 1. DNA的结构的结构 1). DNA 的碱基组成的碱基组成 A G C T少量稀有碱基少量稀有碱基 DNA碱基组成规律碱基组成规律: a. A与与T, G与与C摩尔含量相等摩尔含量相等, A+G=T+C b. DNA碱基组成具有种的特异性碱基组成具有种的特异性 c. DNA碱基组成没有组织器官的特异性碱基组成没有组织器官的特异性 可作为分类依据可作为分类依据 5 5 3 3 2). DNA的一级结构的一级结构 指组成指组成DNA的各核苷酸之间的连键性质及核苷的各核苷酸之间的连键性质及核苷 酸的排序酸的排序(核苷酸单位排序键合核苷酸单位排序键合) 连键连键: 3 ,5 -

17、磷酸二酯键磷酸二酯键 H O - O OCH2 TO=P O- 3 5 OH H O - O OCH2 GO= =P O- 3 5 OH O OCH2 OHH AO=P O O- 3 5 3 5 1 PPP OH ATG pGpTpAOH pG-T-ApGTA 3 3). DNA的二级结构的二级结构 1953年年, Watson & Crick 提出双螺旋模型提出双螺旋模型 指多脱氧核糖核苷酸链内或链间通过氢键折叠指多脱氧核糖核苷酸链内或链间通过氢键折叠 而成的构象而成的构象 依据依据: a. Wilkins & Franlin的小牛胸腺的小牛胸腺DNA-x射线衍射线衍 射图谱分析射图谱分析(

18、不同来源不同来源DNA, 相似结构相似结构) b. 不同来源不同来源DNA, 碱基碱基A=T, G=C c. 碱基配对理化分析碱基配对理化分析 模型要点模型要点: a. 两链反向平行右旋大小沟两链反向平行右旋大小沟 b. 主链在外主链在外, 碱基在侧碱基在侧, 糖环糖环碱基碱基中心轴中心轴 c. 螺径螺径2nm, 螺距螺距3.4nm, 10bp螺旋上升一圈螺旋上升一圈 d. A与与T间两氢键间两氢键, G与与C间三氢键间三氢键 a. 碱基堆积力碱基堆积力(主要主要)由芳环由芳环电子相互作用引电子相互作用引 起的起的, 能形成疏水核心能形成疏水核心 稳定双螺旋的力稳定双螺旋的力: b. 碱基对间

19、的氢键碱基对间的氢键 c. 离子键离子键(磷酸残基与介质中阳离子间形成磷酸残基与介质中阳离子间形成) 2.0 nm 小小 沟沟 大大 沟沟 因含水量不同因含水量不同, 双螺旋有几种类型双螺旋有几种类型 螺距螺距 nm 直径直径 nm 每匝每匝 bp 碱基与水碱基与水 平面夹角平面夹角 A-DNA 2.8 2.3 11 20o B-DNA 3.4 2.0 10 0o C-DNA 3.09 9.33 6o D-DNA 2.43 8 16o Z-DNA 4.5 1.8 12 7o 转变转变(湿度湿度): A(75%)C(4446%)B(92%) SBS模型模型(5右右 5左左)三链单链三链单链 4)

20、. DNA的三级结构的三级结构 在二级结构基础上进一步盘绕扭曲二成在二级结构基础上进一步盘绕扭曲二成 线状线状DNA(ssDNA dsDNA) 环状环状DNA 原核原核 环双链环双链(dcDNA)(dcDNA) 病毒病毒 环单链环单链(scDNA) (scDNA) 超螺旋负超螺旋超螺旋负超螺旋 7 6 40 5 DNA 核小体核小体 螺线管螺线管 超螺线管超螺线管 染色单体染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装一级包装 二级二级 三级三级 四级四级 染色体包装的结构模型染色体包装的结构模型 DNA染色体染色体(约压缩约压缩8400倍倍) 2. RNA的结构

21、的结构 1). RNA的碱基组成的碱基组成 A G C U较多的稀有碱基较多的稀有碱基 大部分为单链结构大部分为单链结构, 若配对则有若配对则有A=U, G=C 2). RNA的一级结构的一级结构 键合键合: 3 ,5 -磷酸二酯键磷酸二酯键 3). RNA的二级结构的二级结构 发夹式结构发夹式结构(螺旋螺旋+突环突环) a. 5 -帽帽子子 (甲基化的鸟苷酸甲基化的鸟苷酸, p268) b. 3 -尾尾巴巴(多多聚腺苷酸聚腺苷酸, polyA) c. 5 -端、端、3 -端含长度不等的非编码区端含长度不等的非编码区 真核生物真核生物mRNA的结构特点的结构特点 4). mRNA AUG UG

22、A UAG UAA CapPolyA翻译区翻译区 非翻译区非翻译区非翻译区非翻译区 起始密码起始密码终止密码终止密码 5). rRNA 6). tRNA的二级结构的二级结构 1965年年, Holley提出三叶草模型提出三叶草模型 a. 由由7695个核苷酸组成个核苷酸组成 b. 四环四环+四臂四臂 c. 氨基酸臂氨基酸臂(5 -pG, 3 -CCAOH) d. 反密码环含反密码子反密码环含反密码子(由三个核苷酸组成由三个核苷酸组成) e. D环含二氢尿嘧啶环含二氢尿嘧啶(D) f. TC环含环含TC序列序列 g. 可变环上核苷酸数目变化较大可变环上核苷酸数目变化较大(分类依据分类依据) h.

23、 含较多的稀有碱基含较多的稀有碱基 tRNA的三级结构的三级结构(倒倒L型型) 三类三类RNA比较：比较： rRNA含量最高含量最高 tRNA分子量最低稀有碱基最多分子量最低稀有碱基最多 mRNA寿命最短寿命最短 7. 其它其它RNA 不均一不均一(hnRNA)小分子小分子(snRNA) 反义反义(asRNA) 核酶核酶(ribozyme) 二二. 性质性质 1. 一般性质一般性质 a. DNA白色纤维状固体白色纤维状固体(丝状丝状), 黏度大黏度大 RNA白色无定形粉末白色无定形粉末, 黏度相对较黏度相对较DNA小小 b. 溶于水溶于水, 不溶于乙醇、氯仿不溶于乙醇、氯仿 2. 两性电解质两

24、性电解质, 酸性较强酸性较强(pI3) 既含碱基既含碱基, 又含磷酸基又含磷酸基, 为两性电解质为两性电解质 可电泳、离子交换层析可电泳、离子交换层析(分离纯化分离纯化) Ion-exchange chromatography Column + anions + + Sample mixture Protein binding Column + proteins Column + anions Ion displacing Purified protein 3. 紫外吸收紫外吸收 碱基环平面共轭碱基环平面共轭, 对紫外光强烈对紫外光强烈 吸收吸收(230-290nm) m=260nm 增色效应

25、增色效应 天然天然DNA 260nm 的光吸收值小的光吸收值小 于各核苷酸总于各核苷酸总 的光吸收值的光吸收值 应用应用 定位核酸在细胞和组织中的分布定位核酸在细胞和组织中的分布 定性定量定性定量(核酸或核苷酸核酸或核苷酸) 4. 变性、复性和分子杂交变性、复性和分子杂交 变性变性 有序的二、三级结构转变成无序的结构有序的二、三级结构转变成无序的结构, 但一级结构不变但一级结构不变 特征特征 生物活性部分丧失生物活性部分丧失, 黏度下降黏度下降, 浮力密度浮力密度 升高升高, 紫外吸收增加紫外吸收增加(增色效应增色效应) 因素因素 加热、酸、碱、搅、振、有机物加热、酸、碱、搅、振、有机物(脲甲

26、醛脲甲醛) 热变性热变性 缓慢加热缓慢加热DNA变性变性 DNA的变性是爆发式的的变性是爆发式的,在很窄的温度区间内在很窄的温度区间内 完成完成, 通常将紫外吸收的增加量达到最大增通常将紫外吸收的增加量达到最大增 量一半时的温度称为量一半时的温度称为熔解温度熔解温度, 用用Tm表示表示 DNA的的Tm值一般在值一般在70-85 C之间之间 影响影响Tm值的因素值的因素 a. G-C对含量对含量: G-C含量高含量高, Tm值高值高 （G+C)%=(Tm-69.3)2.44 b. 溶液的离子强度溶液的离子强度: I高高, Tm高高 c. 溶液溶液pH值值: pH8.3稳定稳定 d. 变性剂变性剂

27、: 破坏氢键破坏氢键 复性复性 变性核酸的互补链在适当条件下变性核酸的互补链在适当条件下, 重新缔重新缔 合成双螺旋结构的过程合成双螺旋结构的过程 复性时复性时, 单链随机碰撞单链随机碰撞, 不能或只能形成局部碱不能或只能形成局部碱 基配对基配对, 在较高的温度下在较高的温度下, 两链重又分离两链重又分离, 经经 多次试探性碰撞才能形成正确的互补区多次试探性碰撞才能形成正确的互补区, 故故 复性温度不能太低复性温度不能太低, 一般以一般以(Tm-25)较适宜较适宜 片段浓度片段浓度(高高, 快快) 片段大小片段大小(小小, 快快) 片段重复序列片段重复序列(多多, 快快) 溶液离子强度溶液离子

28、强度 影响复性的因素影响复性的因素 分子杂交分子杂交 在退火条件下在退火条件下, 不同来源的不同来源的DNA互补区形成互补区形成 双链双链, 或单链或单链DNA和单链和单链RNA的互补区形的互补区形 成成DNA -RNA杂合双链的过程称杂合双链的过程称分子杂交分子杂交 核酸的杂交在分子生物学和遗传学核酸的杂交在分子生物学和遗传学 的研究中具有重要意义的研究中具有重要意义 Southern bolting: DNA-DNA Northern bolting: DNA-RNA Western bolting: Pr-Pr 原位杂交原位杂交: 探针与菌落或组织细胞中的探针与菌落或组织细胞中的 核酸杂

29、交核酸杂交 变性变性DNA与与*RNA 温育温育 除去未杂交的除去未杂交的*RNA 滤除未杂交的滤除未杂交的DNA RNase 移到膜上移到膜上 放射放射, 显影显影 5 降解降解 主链共价键断裂主链共价键断裂 RNA 37, 0.3mol/LKOH, 1h 2 ,3 -环核苷酸环核苷酸 1218h, 水解水解 2 -磷酸核苷 磷酸核苷+3 -磷酸核苷磷酸核苷 DNA 37, 0.3mol/LKOH, 1h 不降解不降解 原因原因: RNA 2 -OH起催化作用起催化作用 通常说通常说DNA抗碱抗碱, RNA不抗碱不抗碱 D-核糖核糖 糠醛糠醛 甲基间苯二酚甲基间苯二酚 FeCl3 深绿色深绿

30、色675-680nm cHCl / D-2-脱氧核糖脱氧核糖 -羟基羟基-酮戊醛酮戊醛 二苯胺二苯胺 蓝色蓝色595-620nm 6 显色反应显色反应 cH2SO4 / 定性定性 定量定量 -H2O 地衣酚反应地衣酚反应 二苯胺反应二苯胺反应 钼蓝反应钼蓝反应 有机磷有机磷 cH2SO4 消化消化 无机磷无机磷 定磷试剂定磷试剂 蓝色蓝色650nm 定性定性 定量定量 (NH4)2MOO4+H2SO4 H2MOO4+(NH4)2SO4 12H2MOO4+H3PO4 H3PO412MOO3+12H2O H3PO412MOO3+Vc MOO24MOO3H3PO44H2O 钼酸铵钼酸铵 钼酸钼酸 磷

31、钼酸磷钼酸 钼蓝钼蓝 作作P标准曲线标准曲线求得无机求得无机P P量量换算得核酸量换算得核酸量 DNA与基因组织与基因组织 DNA 转录转录 RNA 翻译翻译 Protein 基因基因 基因基因 是是DNA分子中最小的功能单位分子中最小的功能单位 结构基因结构基因: 编码功能编码功能 调节基因调节基因: 调节功能调节功能 基因组基因组 逆转录逆转录 基因组基因组 原核生物基因组特点原核生物基因组特点 3.除调节序列与信号序列外除调节序列与信号序列外, DNA的大部分为的大部分为 结构基因结构基因,且每个基因出现的频率低且每个基因出现的频率低 (1次或几次次或几次) 4.功能相关的基因常串联在一

32、起功能相关的基因常串联在一起 (呈操纵子结构呈操纵子结构) 5.有重叠基因有重叠基因 ABC DEFG 1.基因组小基因组小 E.coli 4.2106, 30004000个基因个基因 6.为多顺反子为多顺反子( 能编码几条多肽链能编码几条多肽链) 2.几乎无蛋白质同核酸结合几乎无蛋白质同核酸结合 真核生物基因组特点真核生物基因组特点 3.有重复序列有重复序列 单拷贝序列单拷贝序列: 在整个在整个DNA中只出现一次或少数几次中只出现一次或少数几次 中度重复序列中度重复序列: 重复几十重复几十几千次几千次 高度重复序列高度重复序列:重复几百万次重复几百万次 1.基因组很大基因组很大 人人2.91

33、09bp, 酵母酵母1.3107bp 2.与蛋白质结合与蛋白质结合, 形成染色体形成染色体, 且有多条且有多条 4.基因不连续基因不连续(含居间序列含居间序列不编码多肽的序列不编码多肽的序列) 5.为单顺反子为单顺反子 mRNA 1872bp 内含子内含子(intron): 基因中不编码的居间序列基因中不编码的居间序列 ABCDEG 7700bp F 外显子外显子(exons): 基因中编码的序列基因中编码的序列 transcription 卵清蛋白基因卵清蛋白基因 2.5 核酸的序列测定核酸的序列测定 1.Gilbert的化学的化学(裂解裂解)法法 对待测对待测DNA片断的一端片断的一端(5

34、 -或或3 -)进行放射性标进行放射性标 记记(常用常用P32), 在适宜条件下在适宜条件下, 用不同专一性的化用不同专一性的化 学试剂特异地修饰学试剂特异地修饰DNA分子上的碱基分子上的碱基(仅一个或仅一个或 两个碱基被修饰两个碱基被修饰), 并使并使DNA链在修饰处断裂链在修饰处断裂, 电电 泳泳, 显影显影, 判读判读 专一裂解反应专一裂解反应 G反应硫酸二甲酯反应硫酸二甲酯 G+A反应甲酸反应甲酸 T+C反应肼反应肼+哌啶哌啶 C反应反应NaCl+肼肼+哌啶哌啶 *pGATCGGACCT GG+AT+CC GATCGGACCT GATCGGACC GATCGGAC GATCGGA GA

35、TCGG 末端标记末端标记 专一裂解专一裂解 电泳电泳 显影显影 判读判读 2. Sanger酶法酶法(末端终止法末端终止法) O HOH2C HH OH 1 23 4 5 核 糖 N N N N H H H H 9 腺嘌呤 ddATP PP P 采用采用ddNTP终止反应终止反应 2 ,3 -双脱氧腺苷三磷酸双脱氧腺苷三磷酸 a.DDDP能以单链能以单链DNA 为模板为模板, 合成互补链合成互补链 b.DDDP能利用能利用ddNTP 为底物为底物,掺入寡核苷酸掺入寡核苷酸 链链3 -末端末端, 从而终止从而终止 反应反应 c.反应需引物反应需引物 平行进行四组反应平行进行四组反应, 每组使用

36、相同的模板、相同的引物和每组使用相同的模板、相同的引物和4种种 dNTP, 每组加适量的每组加适量的ddNTP, 使其随机掺入并终止反应使其随机掺入并终止反应 采用荧光替代放射性核素标记采用荧光替代放射性核素标记. 即用不同即用不同 荧光分子标记四种双脱氧核苷酸荧光分子标记四种双脱氧核苷酸, 然后进行然后进行 Sanger测序反应测序反应, 反应产物经电泳反应产物经电泳(平板电泳平板电泳 或毛细管电泳或毛细管电泳)分离后分离后, 通过四种激光激发不通过四种激光激发不 同大小同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四片段上的荧光分子使之发射出四 种不同波长荧光，检测器采集荧光信号种不同波长荧光，检测器采集荧光信号, 并依并依 此确定此确定DNA碱基的排列顺序碱基的排列顺