IgY提取纯化方法

1、IgY 提取纯化方法鸡卵黄中含有水分 48.0%，蛋白质 17.8%和脂肪 30.5%，其中大部分脂肪与结合 以脂蛋白的形式存在。卵黄包括水溶性蛋白 -卵黄球蛋白， - 卵黄球蛋白， -卵 黄球蛋白。 -卵黄球蛋白和各种脂，如 LDL 、HDL 等。所以分离纯化 IgY 的关键 是除去卵黄中高含量的脂及脂蛋白。早在 20世纪 60年代初，科学家就发现鸡卵黄中存在 IgG 抗体，其含量与血清 相似甚至更高，但一直未引起足够的重视，显然是由于很难将 IgG 抗体从丰富的卵 黄脂质中分离出来， 使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。 直到 80 年代初，Polson 和 Jensenius相继建立了有

2、效且相对简便的聚乙二醇（ PEG）提取法和硫酸葡聚糖提 取法，有关这方面的研究便如雨后春笋般大量涌现，并且被广泛应用在生物学的许 多领域。1 IgY 的分离分离的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分（ Water Soluble Fraction， WSF）。常见分离方法有以下几种：1.1 有机物沉淀法 聚乙二醇（ PEG）法和硫酸葡聚糖（ DS）法是比较常用的方法。 一般采用 PBS或 TBS 作缓冲液，将卵黄液稀释 5 倍，加入一定比例的聚乙二醇 6000 （以 3.5%最佳）或硫酸葡聚糖，脂类即发生沉淀， IgY 保留在上清液中。 Schwarzkopf C 等在比较了

3、 6 种分离方法后认为硫酸葡聚糖法具有快速、有效、简便等优点 2 。1.2 有机溶剂抽提法 脂类易溶于有机溶剂，可采用氯仿等进行分离。一个经 TBS 冲洗过的鸡蛋黄制成 15mL 蛋黄液，加入 40mLTBS充分混合后加入 40mL 氯仿，冷 冻离心，分三相。弃去氯仿层，保留水层，中间的半固体相用 40mLTBS 萃取，取水 层，与前一步水层合并即为水溶性组分 Hamada 将蛋黄溶于等体积的盐溶液中，再 与二倍体积的氯仿混合，离心即得水溶性组分。还有学者使用丙酮分离获得水溶性 组分。1.3 天然胶法 Hatta 等认为一些天然胶如卡拉胶和黄原胶可用于卵黄抗体分离。具 体做法是将 9 倍体积的

4、 0.1%（wv）卡拉胶溶液与卵黄混合，离心得水溶性组分。 亦可将卵黄用双蒸水稀释一倍后与 4 倍体积的黄原胶混合，离心得水溶性组分。使 用天然胶法去除脂类比较完全，水溶液中脂类含量少于 0.4%。1.4 中链脂肪酸法 用于卵黄抗体分离的中链脂肪酸是指含 8-10 个碳原子的饱和脂 肪酸，常用的是辛酸。鸡卵黄用去离子水稀释 7.5 倍，混合，离心，上清液再用醋酸 盐缓冲液稀释 2倍，pH值 5.0，加辛酸至浓度为 1%，静置分层， IgY 在水层中。这 一方法的关键在于卵黄的稀释。 Mclaren 也采用了类似的方法，但稀释倍数、 pH 不 相同。1.5 去污剂分离法 一些表面活性剂主要是去污

5、剂可分离卵黄抗体。 有些学者比较了 几种去污剂包括阴离子、阳离子和非离子型去污剂，发现用溴化十六烷基三甲铵进 行分离，脂类的残留量不足 3%，而用十二烷基磺酸钠分离残留量最高， 为 14%35%。 用非离子型去污剂辛苯聚醇 -8(TRITON.RTM.X-114 )分离时，蛋白回收率可达 85% 95%。鸡卵黄用 TBS 稀释 20 倍，离心，取上清液加 6%TX-114，搅拌，升温至 37， 混合物分层，脂类在去污剂相， IgY 在水相中。 Stallberg 用 TX-100 分离，蛋白回收 率可达 97%。泊洛沙姆对鸡卵黄具有良好的脱脂作用，并且具有脂类自然沉降速度 快、对抗体影响小、简

6、化工艺以及本身无毒、无害的特点，适合于卵黄的综合开发 利用2 。1.6 水稀释法 Akita 提出了水稀释法，将卵黄用水稀释 10倍，调 pH值到 5.2，4 静置 6h，上清液即为水溶性组分。也可采用 7倍水稀释卵黄 8。水稀释法工艺简便， 采用适当的方法进行纯化，回收率和纯度都很高。1.7 超临界气体提取法 该法和前面所述方法的主要不同在于不是将卵黄先稀释， 而 是首先通过喷雾干燥获得卵黄粉末。所得卵黄粉末通过超临界提取法去除脂类。其 原理是在高压下二氧化碳液化，将卵黄中的脂溶性物质溶解在其中，并随气流带走。 将卵黄粉末装人超临界气体抽提装置中， 通入 300kg/cm2、40二氧化碳超临

7、界气体 与卵黄粉末混合，在 60kg/cm2、 40的减压条件下，被抽提出的杂质与超临界气体 分开而进入分离室，即得到除去脂肪的卵黄粉末。将去脂的卵黄粉末溶于20 倍磷酸缓冲液中，搅拌、离心，即得水溶性组分。2 IgY 提纯提取的目的是将大量 IgY 从水溶液中分离出来，得卵黄抗体 9。主要通过超滤 法或沉淀法来完成。沉淀法所用的沉淀剂可以是无机物、有机物或有机溶剂，也可以采用多种方法联合沉淀，或沉淀法和超滤法相结合提取。2.1 超滤法 超滤法具有浓缩、 除盐、分级和纯化作用， 使待分离的混合液通过超滤 膜，有目的地除去杂质，保留所需部分。 IgY 的分子质量是 180kD，在提取时一般采 用

8、的超滤膜分子质量截止值是 100kD。Akita 在水稀释法分离后经硫酸钠沉淀， 超滤， IgY 回收率为 9.8mg/mL 蛋黄，纯度 94%10 。2.2 无机物沉淀法 向含有 IgY 的水溶液中加入无机盐或无机盐的过饱和溶液，使 IgY 在高盐条件下沉淀出来。常用的盐有硫酸钠和硫酸铵。 Ntakarutimana 采用氯仿 抽提后，水层经 10%和 36%硫酸钠两次沉淀， 最后采用亲和层析进行纯化。 Svendsen 等比较了硫酸铵盐析法、聚乙二醇法和辛酸法，认为硫酸铵盐析法的 IgY 回收率为 61%，纯度 94%，在三种方法中最高。康亦兼等 8 将卵黄稀释后，取上清液冷冻干燥 得粗分

9、离的 IgY ，再经 60%硫酸铵沉淀一次， 14%硫酸钠沉淀两次， 获得的 IgY 不需 进一步纯化回收率为 94%，纯度 97%。也可用氯化镁等无机物进行沉淀。采用无机 盐沉淀后所得固体，一般需经膜透析除去残留盐分。2.3 有机溶剂沉淀法 Polson的 PEG法采用终浓度为 3.5%的 PEG6000对卵黄进行 分离获得水溶性组分，用 12%PEG 进行沉淀，沉淀经磷酸盐缓冲液溶解后再用 12%PEG沉淀，得IgY 。1985年Polson对此方法加以改进， 先后经 12%PEG和-20 的 50%乙醇两步沉淀法获得 IgY ，回收浓度 4.9mg/mL蛋黄，纯度 89%。也可采用冷 乙

10、醇两步沉淀法从水溶性组分中分离 IgY 。IgY 的提取一般采用联合沉淀法， 即用不 同的沉淀剂对水溶性组分经过两次或多次沉淀，从而获得纯度较高的IgY 11 。除前面介绍的方法外还有使用聚乙二醇 8000 和硫酸铵、硫酸钠和辛酸、硫酸铵和乙醇等 联合沉淀的方法。3 IgY 纯化 为了满足不同使用目的，大多数情况下需对提取得到的卵黄抗体进一步纯化， 除去其中的杂蛋白、盐、沉淀剂或其他杂质，获得高纯度的IgY ，目前主要采用层析方法。3.l 凝胶过滤层析 凝胶过滤也叫分子筛层析。 它主要利用具有网状结构的凝胶分子 筛作用，根据被分离物的分子大小不同来进行。在对 IgY 纯化时常用交联葡聚糖做 凝

11、胶层析介质。 Hassl 等对 PEG 法分离获得的卵黄抗体采用疏水层析和凝胶过滤两 步法纯化，产物纯度较高。 lmL 含 58mg 卵黄抗体的稀释液，经过以上步骤处理后， 卵黄抗体含量依次降至 3.5、4.7和 1.2mg。该法与 Polson PEG法相比，所得产物纯 度和抗体活性均相似，但收率较低。这可能是由于经过两次层析的缘故。3.2 离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子亲和力不同， 借以分 离混合物中各种离子的一种层析法。生物大分子和离子交换剂之间的相互作用主要 是静电作用， 导致介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子发生交换。 IgY 多以葡聚糖交联的弱碱性阴

12、离子交换剂 DEAE 为载体，磷酸盐缓冲液为吸附洗脱 体系进行分离纯化。 Hatta 用 DEAE-Sephacel 柱层析得到 98% IgY ，每个鸡蛋黄得 70-100mg IgY 。陈天豹等 12采用 DEAE-TOY-OPEAL650M 进行一步洗脱得电泳纯 IgY ，总蛋白回收率 93.44%。由于离子交换层析的介质材料及含盐缓冲流动体系类 似于蛋白质稳定存在的生理条件，有利于增加活性蛋白回收率。3.3 亲和层析 亲和层析是利用生物大分子和配体间专一性亲和力而设计的层析技 术。蛋白质、酶等生物大分子和小分子配体在一定条件下能紧密结合成复合物。如 将复合物中某一方固定在不溶性载体上，

13、则可以从溶液中专一性地分离和提纯另一 方。从理论上讲，能产生一个绝对的纯化作用，因此可达到很高的纯度。在 IgY 的 纯化中采用亲和层析法根据配体的不同有以下几种。3.3.1 嗜硫性亲和层析 也称亲硫层析。该法所用吸附剂称 T胶，制备方法为：琼 脂糖凝胶( Sephrose) CL-4B 在 pH12 的条件下用二乙烯砜激活，再在 pH11 的条件 下与 2巯基乙醇反应。依靠活化的琼脂糖上的砜硫醚基团对蛋白质表面适当位点 的特异性吸附，能在高盐环境下选择性地结合IgY 。也可采用柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液为吸附洗脱体系。傅蓉等 13采用嗜硫性色谱法一步分离纯化 IgY ，蛋白回 收率 91.26%

14、，活性回收率达 70%，IgY 为电泳纯，该法的 IgY 回收率可达 99%。3.3.2 固相金属离子亲和层析 固相金属离子亲和层析常用的金属离子有 Cu2+、Ni2+、 Co2+、 Zn2+等， Greene CR等研究表明 Fe3+与磷酸化氨基酸有很强的亲和力。用亚氨 乙酰乙酸( IDA )活化的琼脂糖 6B 装柱，然后用 FeCl3.H2O 将其转化成 IDA-Fe3+， 加入 IgY 提取液，经 pH梯度洗脱。基于不同 pH有 4个洗脱峰， IgY 经纯化得 4个 亚群14。该法可用于大规模工业化生产。由以上可以看出，在很多情况下经过分离和提取就可以得到纯度较高的卵黄抗 体。衡量一个方法的好坏要考虑到分离、提取和纯化的全过程，并从工艺路线长短、 工艺条件难易以及回收率和纯度等方面综