RCS大鼠视网膜色素变性过程中NogoA蛋白表达-第三军医大学学报

1、NogoA 、 B 蛋白在 RCS 大鼠视网膜色素变性过程中表达的研究耿慧萍，贺翔鸽 (400042 重庆，第三军医大学第三附属医院野战外科研究所，眼科医院)【摘要】 目的 观察髓磷脂抑制蛋白 NogoA 、 B 在遗传性视网膜色素变性( retinitis pigmentosa, RP )经典遗传模型皇家学院外科大鼠 ( Royal college of surgeons rat, RCS ) 出生 后视网膜变性发展过程中的表达并探讨其意义。 方法 按出生后视网膜变性的发展程度将 RCS-p+ ( 视网膜含色素的变性大鼠 )分为 P15d 、P30d 、P60d 和 P90d 4 组， 采用

2、相应时期 的 RCS-rdy+p+( 视网膜含色素的正常大鼠) 作为对照，利用亲和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IH) 及免疫印记 (western blotting ， WB )技术检测两组 RCS 视网膜上 NogoA 、B 蛋白的表达趋势。结果 与对照组相比， 1、 P15d 和 P30d ， RCS-p+ 大鼠视网膜各层结构和细胞数目无明显变化，仅节细胞数目轻微减少；P60d 、P90d 大鼠视网膜外核层 (Outer nuclear layer ，ONL) 和内核层 (Inner nuclear layer ，INL) 结构出现明显紊乱，细胞数 目的减少

3、以 ONL 和神经节细胞层 ( Ganglion cell layer ， RGC) 层为主。 2、IH 显示 NogoA 、B 蛋白在 RCS-p+ 大鼠各时间段视网膜表达均为阳性， P15d 开始出现，随病程发展呈升高趋 势，主要表达在 INL 和 RGC 层，阳性细胞数目显著高于对照组。3、WB 免疫印记检测结果显示 P15d 、P30d 、 P60d 和 P90d NogoA 蛋白表达量分别为：0.827370.21292 、1.11019 0.08999 、1.31552 0.02857 、 1.26881 0.08042 ，与对照组相比有显著差异 (P 0.05) 。同 时检测到

4、NogoB 1 蛋白和 NogoB 2 蛋白的表达，其中 NogoB 2蛋白与 NogoA 蛋白表达趋势 一致，但总体表达量较低。 结论 RCS 大鼠视网膜色素变性发展过程中， RGC 层与视 网膜外层结构同时出现改变。色素变性视网膜上NogoA 、B 蛋白的表达，证明 RP 过程中视网膜视神经损伤的存在， NogoA 蛋白可能参与了视网膜色素变性过程中视神经再生修复 的抑制作用， NogoB 蛋白的作用尚不确定。关键字 视网膜色素变性； Nogo 蛋白；皇家外科学院大鼠 RCS (Royal college of surgeons rat, RCS ) 中文图书分类号 R774.1The e

5、xpression of NogoA protein in the degeneration of retinitis pigmentosa Geng Hui-ping ， He Xiang-ge * Department of Ophthalmology, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, ChinaAbstract ObjectiveTo Investigate the expression tendency and

6、 significance of NogoA 、 B protein in retinaof RCS (Royal college of surgeons rat, RCS rat),a classic genetic animal model with hereditary retinal degeneration after birth. Methods According to retinal degeneration development status, RCS-p+ (RCS rats with inherited retinal dystrophy) were divided i

7、nto 4 groups: P15d 、 P30d 、 P60d 、 P90d, respectively the corresponding period of the RCS-rdy+p + (RCS rat without retinal degeneration) served as the control groups (C15d、 C30d 、C60d 、 C90d),immunohistochemical techniques and immune imprinting ( Western blottingWB )method were used to detect theexp

8、ression pattern and the quantity change of NogoA 、 B protein in retinal tissue of RCS rats ( RCS-p + / RCS-rdy+p + ) at 4 time points postnatal. Results Compared to the control groups, 1, no obvious change appears at the cell number and the thickness of the retina in the P15d and P30d, except for th

9、e slight decrease of RGC number; but In the P60d and P90d, we can observed apparent structure disorder in ONL and INL of retinal. In addition, the most pronounced less number of cells appeared in ONL and RGC layer.2, Immunohistochemistry showed obvious positiveexpression of NogoA 、 B protein appeare

10、d in each period, beginning at P15d and increased with the retinal degeneration process, mainly located in INL and RGC layer. The positive expression is obviously higher than thecontrol. 3, WB immunoblotting show that at P15d 、P30d 、 P60d 、P90d, the gray value of NogoA protein were respectively 0.82

11、737 + 0.21292, 1.11019 + 0.08999, 1.31552 + 0.02857, 1.26881 + 0.08042, which is significant different with the control groups （P 0.05）. At the same time, we detected that the positive expression of NogoB 1 and NogoB 2, NogoB 2 protein have the consistent expression tendency with NogoA protein, but

12、the quantity is lower relatively. Conclusion: During the retinal degeneration process of RCS rat with retinitis pigmentosa, simultaneously morphological changes appeared in RGC layer and the retina outer layer. The expression of NogoA、 B in the INL andRGC layer is one of the evidence for optic nerve

13、 damage during the degeneration of retinitis pigmentosa. Therefore, NogoA protein possibility involved in the inhibiting the regenerate and repair of optic nerve during the degeneration of retinits pigmentosa ， the affect of NogoB can not sure.key words Retinitis pigmentosa ； Nogo protein ； Royal co

14、llege of surgeons rat, RCS作者：耿慧萍 女 硕士 初级 青光眼视神经保护的诊断和研究836066296Corresponding author: HE Xiangge E-mail: 原发性视网膜色素变性亦称为色素性视网膜炎 （ retinitis pigmentosa ，RP ）,是一类以进行性感光细胞 和色素上皮层功能障碍为特征的遗传性视网膜退行性疾病，但其最终致盲的主要原因是视神经的损伤。 Nogo 蛋白是一种髓磷脂抑制蛋白，对中枢神经系统（Central nervous system

15、 ， CNS ）神经损伤后神经元轴突生长具有明显抑制作用。最近研究表明 Nogo 蛋白在多种眼科疾病及视神经损伤中也发挥一定抑制作 用，但在 RP 这种退行性视网膜变性疾病过程中是否也存在直接导致视神经细胞凋亡的抑制因素如 Nogo 蛋白， 尚未见报道。 本研究主要对 RCS 大鼠视网膜变性过程中 NogoA 、B 蛋白的表达进行观察， 为进一 步探索 RP 的发病机制和治疗方法奠定基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物 分别取出生后 15 天（标记为 P15d ， post-natal 15 day ）、 30 天（P30d） 、 60 天（P60d） 、 90 天 （P90d

16、） 四个时间点的 RCS 大鼠 （RCS-p+, 视网膜含色素的变性大鼠） 做为实验组，以相同时间点的（RCS-rdy+p+ ，视网膜含色素的正常大鼠 ）作为对照组 （由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验 动物中心提供） ，每个时间点各取大鼠 5 只，雌雄不限。1.1.2 主要试剂与仪器 兔抗大鼠 Nogo A+B 多克隆抗体（英国 Abcam 公司， ab47085 ），辣根过氧化物 酶（HRP ）标记山羊抗兔 IgG 抗体（北京中杉金桥生物技术公司） ，TritonX-100（ 美国，sigma 公司，9002-93-1 ）， 化学增强发光试剂盒（ Western Blot Chemi

17、luminescence Reagent Plus ），冰冻切片机型号 Leica CM1900 （德 国 Leica 公司），光学显微镜（德国 Leica 公司）， DU-600 紫外分光光度计（ Beckman ，美国），电泳仪及 电泳槽（ BioBad ，美国），TRANS-BLOT SD 半干电转移细胞 （ BioRad ，美国），扫描分析软件系统 （Labworks Aanlysis Software ，美国）1.2 方法1.2.1 亲和免疫组织化学技术 视网膜石蜡切片准备 速眠新 （1ml/kg） 腹腔麻醉，打开胸腔左心室插管，剪开右心房， 0.9%Nacl 溶液灌注

18、冲洗至流出液基本清亮，用预冷的 4% 多聚甲醛灌注，取双侧眼球置于4%的多聚甲醛 4固定过夜。 Zeiss 手术显微镜下去除眼前节及玻璃体，常规石蜡包埋，制成 5um 厚的连续石蜡切片。 免疫组化反应 石蜡切片脱蜡至水， 蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5分钟，采用胰酶修复抗原后 3%H 2O 2 室温孵育 5-10 分钟， PBS 冲洗 5分钟，置于 0.3%Triton X-100 浸泡 10min ，室温下 5-10%血清封闭 30 分钟， 在 PBS 漂洗 5 分钟。 将切片用兔抗大鼠 NogoA+B 多克隆抗体（ 1:1500 ，北京中杉金桥生物技术公司抗体 专用稀释液稀释

19、） 先 4过夜，后室温 37下孵育 60min ；对照组用 PBS 液代替一抗。 接着 PBS 漂洗 5min3 次。滴加适当比例稀释的山羊抗兔生物素标记二抗（1:200），37或室温孵育 60min 。PBS 漂洗 5min3次，滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素, 37 或室温孵育 30min 。PBS 漂洗 5min3 次，DAB 显色，复染，脱水，透明，封片。最后在光学纤维镜下观察，拍照。1.2.2 Western blot 免疫印迹技术 视网膜组织蛋白提取及鉴定 速眠新麻醉，断颈处死，直接取双侧眼球置于冰盒内， Zeiss 显 微镜下去除眼前节，剥离视网膜，剪取 1-2

20、g 置于冻存管中， -80保存备用。取视网膜标本 2g 加细胞裂 解液 1ml ，冰浴下超声破碎 15s ，冰浴 30min ，4, 2000g ，30min 。上清冷冻干燥 24小时，用含蛋白酶稀 释剂的 PBS 稀释蛋白沉淀。每个标本蛋白浓度用考马斯亮蓝法定量，制作蛋白标准曲线，找到样品蛋 白对应的吸光度值和浓度，该浓度乘以样品的稀释倍数即为样品的原始浓度。 蛋白质 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及转移 按常规制备体积分数 7.5%的分离胶和体积分数 为 4%的积层胶，各取 20ul 上清液， 100 加热变性 5 分钟，通电电泳后用半干电转移法将蛋白质转移至 PVDF 膜

21、，根据所需蛋白质的质量按 Marker 剪开膜后加入封闭液室温封闭 1-2h ，置于 4冰箱过夜。后 PBS 冲洗加入兔抗大鼠 Nogo A+B 多克隆抗体 20ul(1:1000) , 同时加入山羊抗GAPDH 单克隆抗体10ul(1:2000) /小鼠抗 -action 单克隆抗体 10ul ，室温反应 1h。PBS 洗涤后加入抗鼠和抗兔 HRP-IgG 3% 30ml 各加 12ul (1:2500 )，室温孵育 1h 后充分洗涤，加入发光底物，经胶片曝光、显影、定影，显现特异蛋 白质信号。实验重复 3 次，条件完全一致。1.3 统计学分析方法 本研究采用 SPSS13.0 统计学软件，

22、 计量数据采用均数 标准差表示。 使用 quantity one -灰度分析软件和 IPP 图像分析软件， 对不同时间点实验组和对照组的Western blotting 条带的灰度比值进行比较，在符合正态性和方差齐性的条件下，进行单因素方差分析法分析。以 P 0.05 表示差 异有统计学意义， P 0.01 表示差异具有显著统计学意义2 实验结果2.1 免疫组化结果：注：实验组 RCS-p+ 对照组( RCS-rdy+p+ )图1：光学显微镜下显示 RCS大鼠出生后视网膜 NogoA 、B蛋白表达情况 A-D分别示RCS-p+ （含色素的变性大鼠 -免疫组化染色阴性对照 ） 出 生后 P15d

23、、P30d、P60d、P90d 病变过程视网膜结构变化，中后期和晚期视网膜ONL 层结构重度紊乱，厚度明显变薄， INL层结构明显紊乱，但厚度轻度变薄 E-H 分别示 RCS-p+ （含色素的变性大鼠 ）出生后病变过程中 P15d 、P30d 、P60d 、P90d ，NogoA 、B 蛋白在视网膜上的表达， 可见视网膜 RGC 层和 INL 层呈明显阳性染色， INL 层染色以 P15d 较明显（黑色箭头所示） ,ONL 层几乎无表达。RP 发展过程中 RGC 层 NogoA 、 B 蛋白阳性表达呈动态变化，随变性发展过程呈表达增加趋势 I-L 分别示 对照组 RCS-rdy+p+ （含色素

24、的正常大鼠 ）出生后发育过程中 P15d 、 P30d 、P60d 、 P90d ，NogoA 、 B蛋白在视网膜上的表达，可见 RGC 层呈少量阳性染色（黑色箭头所示） ，各年龄阶段 NogoA 、B蛋白表达无 明显差异。 免疫组化 4002.2 Western blotting结果及统计学分析2.2.1 Western blotting 条带结果：视网膜组织各组不同时间点 Nogo 蛋白表达情况图 2 免疫印记法检测 NogoA 蛋白在 RP( RCS-p+/ RCS-rdy+p+ )病程四个阶段中视网膜中的表达量(C： RCS-rdy+p+ control groupsP: RCS-P+

25、 cases groups1：P15d 2 ：P30d 3 ：P60d 4 ： P90d )图 3 免疫印记法检测 NogoB (B 1 /B 2)蛋白在 RP( RCS-p+/ RCS-rdy+p+ )病程四个阶段中视网膜中的表达量(C： RCS-rdy+p+ control groupsP: RCS-P+ cases groups1：P15d 2 ：P30d 3 ：P60d 4 ：P90d )2.2.2 Nogo 蛋白表达强度 我们采用目的蛋白质灰度值与内参蛋白质灰度值的比值来表示目标蛋白的表达强度，即目的蛋白质条带灰度值/ -action （GAPDH ）带灰度值 不同时期

26、视网膜 NogoA 蛋白表达情况见表 1：表 1 不同时期视网膜表达 NogoA 蛋白灰度值比较（ XS n=4 ）组别15d不同时间点的平均灰度值30d60d90d实验组0.827370.212921.110190.089991.315520.028571.268810.08042对照组0.428170.189690.406340.064880.445010.058350.409060.08159P值0.0310.0000.0000.000注： 实验组： P15d、P30d 、P60d 、P90d 四个时间点蛋白表达量相比，P=0.000 0.05.结果】与对照组相比，NogoA 蛋白灰度值

27、在 P15d 就显著增高，持续增高至 60d， 90d 时有所下降。Western blotting 灰度积分柱状图 不同时期视网膜 NogoB 1 蛋白表达情况见表 2表 2 不同时期视网膜表达 NogoB 1 蛋白灰度值比较( XS n=3 )组别不同时间点的平均灰度值15d30d60d90d实验组0.12027 0.013860.06682 0.009670.04467 0.012150.19186 0.02138对照组0.11728 0.165170.14660 0.017610.12903 0.014020.16153 0.00681P值0.9770.0020.0010

28、.079注：实验组： P15d、P30d、P60d、P90d 四个时间点蛋白表达量相比 , P= 0.000 0.05.结果】：与对照组相比，视网膜 NogoB 1蛋白的表达量无明显趋势变化规律。Western blotting 灰度积分柱状图 不同时期视网膜 NogoB 2 蛋白表达情况见表 3表 3 不同时期视网膜表达 NogoB 2 蛋白灰度值比较( XS n=3 )15d30d60d90d实验组0.31943 0.004430.36996 0.004450.41583 0.004480.42823 0.00942对照组0.2801 0.018610.27155 0.015

29、130.2365 0.023210.16143 0.01841P值0.0240.0000.0000.000组别不同时间点的平均灰度值注：实验组： P15d、P30d、P60d、P90d 四个时间点蛋白表达量相比， P=0.000 0.05.对照组： P15d 、P30d 、P60d 、P90d 四个时间点蛋白表达量相比， P=0.000 0.05结果】：与对照组相比，视网膜 NogoB 2蛋白的表达量和 NogoA 具有一致的表达趋势，随病程呈现显著升高趋势。Western blotting 灰度积分柱状图3 讨论视网膜色素变性是一种以感光细胞的凋亡为主要特征的致盲性疾病。 RCS 大鼠是研究

30、 RP 的经典模 型，具有和人类 RP 相似的病理变化及功能特征。本研究发现在 RCS 鼠病变早期，视网膜内层 RGC 细 胞的数目就开始轻微减少， 随着光感受器细胞变性和缺失， 节细胞早期即出现死亡。 而视网膜内层 RGC 数目减少的同时，也必然伴随全部视网膜细胞连接的重组及可塑性改变。但随着异位细胞如 muller 迁 入视网膜内层和胶质细胞增生， 节细胞数量上的缺失易被掩盖， 以至难于被发现， 故检测到轻微的节细 胞缺失即意味着比较严重的 RGC 的改变 1 。对 RP 另一遗传动物模型如 P23Hrat 进行病理结构研究和 本实验结果一致， 证实在其变性过程也伴随 RGC 细胞形态、

31、功能学的改变 2 ，但在 rd1 和 rd10 等遗传 模型中并未探测到功能学改变 3-6 ，表明 RP 变性过程中 RGC 和视神经的改变存在模型差异性。 以上 研究说明在视网膜变性的早期不仅存在感光细胞的变性，也存在神经节 RGC 细胞的凋亡。因此，在 RP 治疗策略相关研究中不应只局限于感光细胞的改变对 RP 的影响，病变早期给予视网膜 RGC 细胞 的神经保护性干预对延缓 RP 患者视力的丧失具有重要意义。Nogo 蛋白是具有重要 CNS 神经抑制作用的少突胶质细胞源性的髓磷脂抑制因子，存在三种基因编 码蛋白 NogoA 、B、 C。研究多集中于 NogoA 蛋白，主要表达在 CNS

32、少突胶质细胞和一些神经元中， 以胶质细胞为主 7-8 ，它存在两个活性抑制功能区域： Nogo66 、amino-Nogo (NIG), 功能性研究指出这 两个抑制区域很可能在髓磷脂和少突胶质细胞受损后暴露出来， 后被分泌进入到细胞外基质， 从而发挥 抑制神经轴突再生的作用 9 。且少突胶质细胞要发挥抑制 CNS 再生作用主要就是通过细胞表面的髓磷 脂抑制蛋白如 Nogo 、MAG 、OMgp 及蛋白聚糖 V2 等10 。除了 CNS 以外， Nogo 等髓磷脂抑制因子在 机械伤、钳夹伤、高眼压所致眼部视神经损伤后的再生抑制中也起到重要作用 11-13 。那么在 RP 这种慢性退行性视网膜变性

33、过程中是否同样存在 Nogo 的抑制作用呢？本研究利用亲 和免疫细胞化学技术和免疫印迹法 Western blotting 发现在 RP 变性发展的四个阶段中， NogoA 、B蛋 白均有表达，且在变性早期即出现，表达部位主要在 RGC 层和 INL 层， ONL 层几乎无表达，并呈现 随病程发展逐渐增加的趋势，表明 Nogo 蛋白可能参与了 RP 疾病发展过程。 RP 病理学研究证实感光 细胞凋亡后出现了视网膜二级、三级细胞的变性和凋亡，且视网膜主要胶质细胞 muller 细胞活化、增 殖和迁徙也是 RP 变性的一部分， Muller 细胞对视网膜损伤具有高度敏感性， Muller 细胞过度

34、活化和增 生可导致神经退变和阻抗神经再生 10 。因此 RP 中神经元和视网膜 muller 细胞的损伤，可能是少突胶 质细胞源性的髓磷脂抑制因子 Nogo 蛋白表达的病理学基础。 本研究结果显示 NogoA 、B 蛋白在 RP 病 程发展过程中视网膜上的动态表达变化也进一步验证了在视网膜色素变性过程中存在的视神经损伤及 Muller 细胞的激活，以上结果表明 NogoA 蛋白可能参与了 RP 视网膜损伤后视神经的再生抑制作用。以往关于 RP 治疗方法的研究主要针对初始病变部位 RPE 和感光细胞，并未考虑到视网膜变性过 程中抑制性因素对视神经再生的作用。 目前对 RP 病程中导致视神经再生修

35、复困难的原因尚无确切的结 论。本研究从另一个角度证实在 RP 变性过程中存在少突胶质细胞源性的髓磷脂抑制因子NogoA 、B蛋白的表达，这将对进一步探索 RP 的病理机制和治疗方法具有重要意义。参考文献..2.13.Marc, R., et al., Neural reprogramming in retinal degeneration. Investigative ophthalmology & visual science, 2007. 48(7): p. 3364.Kolomiets, B., et al., Late histologic

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