血红蛋白电泳检查电泳法作业指导书

1、血红蛋白电泳检查电泳法作业指导书1. 原理血红蛋白是由两对多肽链组成的复杂分子。每一条链含 有血红素和络合铁原子的卜啉。所有血红蛋白的血红素部分 都是相同的。所测定的血红蛋白的蛋白部分称之为珠蛋白。 正常人血红蛋白多肽链包括a、B、3和丫。血红蛋白的结 构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基 酸不同可形成不同的血红蛋白，其表面电荷不同，在电场中 的泳动率不同。本实验在碱性（PH=8.60 ）条件下，以琼脂 糖凝胶电泳的方法进行，对红细胞洗涤后造成溶血，电泳分 离血红蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液体洗 去。待琼脂糖凝胶板干燥后，肉眼可直接判别有无电泳条带 异常。运用光密度

2、扫描仪检测准确定量分析电泳条带异常情 况。血红蛋白异常有二种类型：血红蛋白性质或结构的异常 称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红 蛋白性质异常，称之为地中海贫血。2. 标本米集2.1标本米集前病人准备：受检者应空腹。2.2标本种类：抗凝血 2.3标本要求：抗凝剂选用EDTA柠檬酸或肝素均可，避免 碘乙酸。常规静脉采血1.8ml ，加入含有109mmol/L枸橼酸 钠溶液0.2ml的干燥。清洁试管中，充分混匀。4. 标本储存：储存于2-8 C冰箱中，5天。5. 标本运输：储存于2-8 C状态下的冰壶或泡沫箱密圭寸运 输。6. 标本拒收标准：细菌污染、溶血或脂血标本不能作测定。7.

3、 试剂7.1试剂名称：血红蛋白电泳检查试剂7.2试剂生产厂家：法国Sebia公司7.3包装规格：150tests7.4试剂盒组成琼脂糖凝胶10块溶血素 1瓶缓冲液条带10包x 2条薄滤纸 1 x10张氨基黑（浓缩液）1瓶x 100ml点样模具滤纸10条x 1盒7.5 试剂储存条件及有效期：贮存于室温（1530 C ）或冰箱（28 C）,不能冷冻。有效期两年8.仪器设备8.1仪器名称：SEBIA电泳仪8.2仪器厂家：法国Sebia公司8.3仪器型号：HYDRASYS9.操作步骤9.1 血红蛋白液制作：抗凝血离心，5000rpm , 5分钟，去掉 血浆，用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞3次，若红细

4、胞 体积小于10ul，需特别小心。取10ul红细胞加入130ul溶 血液造成溶血。震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟待测。 9.2启动电泳仪9.3将加样器放在一平板上，有数字的一端向上。各加样孔 加入10ul溶血的样品，2分钟内加样完毕。将加样器放入保 湿盒内，齿端向上（转运时用塑料齿保护架）。等待5分钟， 使样品扩散至齿端。打开电泳仪盖，抬起电极和加样器支架。9.4 使用 HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINCE 时选择仪器的“ HBTOTAL程序（位于链盘左侧）。9.5从包装袋内取出缓冲条，拿出末端的塑料片，将缓冲条 两端塑料片固定在电极支架背侧的钉上，塑料片应紧贴支 9.6取出凝

5、胶板。将薄的滤纸轻轻吸去凝胶板表面的多余液 体，然后立即丢弃滤纸。在电泳仪温度控制板表面的边线内 加200ul蒸馏水或去离子水。凝胶面朝上，放置凝胶板，边 缘对齐边线。略略将凝胶弯曲，然后放平，使水均匀分布在 凝胶板下面而不含气泡。9.7降低支架，使缓冲条不接触到凝胶板。9.8从保温盒里取出加样器。取时拿保护框。折断加样器齿 端保护框。将加样器放在4号位置。9.9关上电泳仪盖子，按下键盘左侧的绿色箭头“ START” 键，电泳开始。9.10凝胶染色扫描9.10.1 打开盖子9.10.2 取出并丢弃加样器9.10.3 升高两个支架，握住塑料端取出并丢弃缓冲条。9.10.4 打开凝胶托架，平放，将

6、干燥的凝胶片放入两层间， 然后关上托架。9.10.5 将凝胶支架放入染色池9.10.6 取出凝胶支架，打开盖子，取出干燥的凝胶片。9.10.7 在光密度仪的570nm处或以黄色滤光片扫描测定。 使用HYDRYS DVSE或PREFERENCE密度仪时，使 A片段的 标记置于扫描板5mm的标志处。10. 结果判断与参考范围扫描得到的只是每种血红蛋白条带的相对浓度值。取出 胶片后，首先清洁胶片的背面。判断溶血液的浓度是否合适, 主要看基质带的浓度，如基质带浓度过淡，说明溶血液的浓 度太淡。正常时A2浓度大约为基质带浓度的1-2倍。半岁-成人:HbA 三 94.5 % ,HbF 2.0 % ,HbA

7、2 3.5 %1 个月：HbA 12-40 % ,HbF 60-93% ,HbA2 0.1-1.0%6 个月：HbA 86-98 % ,HbF 0.84-10.7% ,HbA2 0.87-2.9%脐 带血：HbA 4-40 % ,HbF 30-96% ,HbA2 1.0 %11. 质量控制建议测定每一批样本时都附有一控制品或含有血红蛋白 A,F,C和S的血样本。12. 临床意义12.1 检测B -地中海贫血12.1.1 轻型：HbA轻度升高，大多在4% -8 %12.1.2 中间型：HbAA缺如，HbF可达10 %12.1.3 重型：HbF: 30 % -90 %, HbA 多低于 40 %

8、或甚至 0 %12.2 检测a -地中海贫血12.2.1 标准型a -地中海贫血：新生儿期HbBart s可达5 % -15 % ,几个月后消失。经煌焦油蓝温育后，少数红细胞内 有H包涵体。血红蛋白电泳无异常发现。12.2.2 血红蛋白H病：HbH在PH8.6或8.8电泳时，向阳极方向移动，泳速快于HbA;在PH6.5电泳时，仍向阳极方向移 动。12.2.3 血红蛋白Bart胎儿水肿综合症：Hb Bart s占80% -100 % ,可有少量HbH。HbA、A及F均缺如。12.3 检测血红蛋白病：引起临床注意的异常血红蛋白有四 种：S, C, E 和 D。12.3.1 血红蛋白S:在碱性缓冲条

9、件下血红蛋白S的条带位 于A和A片段之间12.3.2 血红蛋白C：在碱性缓冲条件下血红蛋白C, E和A 的条带重叠在一起。若这一片段15%，应怀疑有血红蛋白 C或E的异常。12.3.3 血红蛋白E:与血红蛋白C不同的是，E在酸性凝胶 电泳中不与A分离。1234 血红蛋白D:在碱性缓冲条件下，血红蛋白D和S的 条带重叠在一起，但D在酸性凝胶电泳中不与A2分离。13. 操作性能：灵敏度高、特异性强、操作简便，重复性好。14. 注意事项：14.1 试剂贮存于室温（1530 C ）或冰箱（28 C ）内， 不能冷冻。14.2 不要应用溶血标本14.3 若检测到异常血红蛋白，而又与常见的异常血红蛋白 S,C,D或E不同，可使用其他方法（如球蛋白链电泳）检测， 或求助于有关专门实验室。14.4 HbF小于全部血红蛋白的2 % -3 %时，扫描检测HbF（或 其它一些较少见的血红蛋白）只是半定量的，结果不