抗原特异性Th17细胞的分化与调节

1、抗原特异性 Th17 细胞的分化与调节 按照CD4+T细胞分化和功能特征可以将其分为Th1和Th2细 胞1。Th1型细胞通过分泌干扰素 丫（ IFNy）等细胞因子介导 细胞免疫； Th2 型细胞通过分泌 IL4 等细胞因子介导体液免疫 2 ， 3 。 Th1 型免疫反应失调， 出现组织损坏和慢性炎症， 而 Th2型免疫反应失调，则导致过敏和哮喘疾病的发生3。近年 来， 在类风湿关节炎、 实验性自身免疫性脑脊髓炎等自身免疫 病和过敏原特异性反应研究中发现一种特殊的辅助型T细胞。这 群CD4+T细胞同传统Th1和Th2细胞具有明显不同的特征：主 要分泌 IL17， 表达控制其分化的独特的转录因子孤

2、独受体 （orphan nuclear receptor , RORy t） 4, 因此命名为 Th17 细胞。目前对于此细胞亚群的研究主要集中于其在疾病的发生发 展中的作用，而探讨影响抗原特异性 Th17细胞的诱导和分化因 素的报道较少。为此， 我们研究了体外培养体系中， 初始抗原 特异性TCRTg CD4+T田胞， 经抗原刺激后，探讨影响Th17细 胞的诱导、分化和调节的因素。为深入研究CD4+T细胞免疫调 节效应和探讨自体免疫性疾病等免疫学机制提供实验和科学依 据。 1 材料和方法 1.1材料OVA抗原特异性转基因 BALB/c小鼠（DO11.10, TCRTg 雌性，68周龄）， 购自

3、实验动物中心。PerCP标记 的抗 CD4(PerCPCD4、APC标记的抗 IFN 丫(APCIFN)、PE 标记的抗IL17 ( PEIL17)均购自美国 BD/Pharmingen公司。FITC 标记的抗KJ1.26单克隆抗体(mAb 特异性识别转基因 OVA抗 原受体表达的细胞， 购自 Caltag Laboratories ( CA)。 Recombinant Murine IL6 、human IL2 和 TGFB 购自 PEPROTECH 公司。LPS和布雷菲德菌素(brefeldin A , BFA)购自Sigma 公司。antiIFN 丫 和 antiIL4 购自 BioLe

4、gend 公司。IL2、IFN 丫 ELISA kit和FACS Calibur流式细胞检测仪购自 BD公司。Mouse IL23、IL4 和 IL17 ELISA kit 购自 R&D公司。RPMI1640培养液 购自 Gibco 公司。小鼠淋巴细胞分离液购自达科为公司。 ELX800 Universal Microplate Reader 酶联免疫检测仪购自 BioTEK instrument.INC 德国。 1.2 方法 1.2.1 TCRTg BALB/c 小鼠单个细胞的制备 简言之， 取小 鼠的脾脏， 研磨， 筛网过滤， 然后经小鼠淋巴细胞分离液密 度梯度离心 ( 800 r/min

5、 ， 30 min)， 收取单个核淋巴细胞， 计 数，用RPMI1640培养液(含100 mL/L灭活胎牛血清、50 g/L 谷胺酰胺、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、50 mol/L2ME) 调整细胞密度为3X 109/L。 1.2.2细胞培养 新鲜分离的DO11.10小鼠单个核细胞与同 背景BALB/c小鼠单个核细胞悬液按1 ：4比例混合，在有/无 OVA多肽(OVA323339, 1 mg/L)、相应细胞因子(TGFp 1 卩 g/L、 IL610 a g/L、IL23 10 卩 g/L 或抗细胞因子抗体 a IFN 丫 5 mg/L、 a IL45 mg/L )不同组合

6、的情况下培养 4 d后， 新鲜RPMI1640 培养液中加入低剂量IL2 ( 10 U/mL)继续培养2 d，收集细胞， 加入OVA多肽和a CD28 (终浓度1 mg/L),刺激的第1 h后， 加入BFA继续培养4 h ,用于细胞内细胞因子染色。 1.2.3 ELISA 检测 培养 4 d 的细胞， 收集上清液， 低剂 量IL2 (10 U/mL)悬浮细胞2 d ,调节细胞密度到 3X 109/L。 刺激孔加入OVA多肽和a CD28每个样品于96孔培养板上置3 个复孔，200 a L/ 孑L,37C、50 mL/L CO2培养 48 h 后， 收 集培养上清液，检测细胞因子浓度，按照ELI

7、SA试剂盒说明书 操作, 酶联检测仪检测结果。 1.2.4 细胞染色 首先进行细胞表面染色, 简言之, 细胞 悬液，加入荧光标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体，4 C避 光反应 30 min , 洗涤 2 次( 800 r/min , 8 min )。之后进行 细胞内细胞因子染色，即将待测细胞用PBS洗涤2次后，加入 40 mL/L 多聚甲醛, 室温固定 8 min, 洗涤, 加入含有通透剂 的缓冲液4C过夜破膜，加入特异性的胞内标记 mAb 4C避光 反应 30 min ， 洗涤 2 次， 染色缓冲液重悬细胞， 流式细胞术 (FCM进行检测。 1.2.5 FCM分析 应用FCM进行检测。首先设门于淋巴细胞， 再以CD4+KJ1.26+双标记细胞群开窗，CellQuest收集10000个 细胞，FlowJo软件分析FCM结果。1.2.6统计学处理所 获数据用xs表示，显著性检验采用t检验分析。 2 结果 2.1 TGFB和IL6诱导抗原特异性Th17细胞的分化DO11.10 小鼠和BALB/c小鼠单个核细胞悬液，在OVA多肽和相应细胞因 子