生物技术制药实验指导

1、生物技术制药实 验 指 导主编王金华 苏华伟西南林学院资源学院生物技术教研室二oo三年十二 月目 录序 言ii一、生物药物原料的选择、处理与保存1二、包埋法制备固定化细胞3三、吸附层析提取鸟巢菌素5四、液相层析分离、纯化蛋白质类药物7五、半成品药物质量检测蛋白质含量测定10六、蛋白质药物相对分子量测定sds-page13七、蛋白质药物纯度检测sds-page18八、抗体诊断玻片直接凝集法检测血型20九、单克隆抗体的制备22十、植物药物制备技术实验25十一、大蒜细胞sod的提取与分离30十二、动物药物制备实验卵磷脂制备34十三、设计实验分泌抗生素的微生物菌种的选育附 录37 序 言 生物技术是一

2、门具有悠久历史、又与现代科学和技术密切结合的学科。20世纪70年代以来，dna重组技术等分子生物学技术的不断发展，赋予了生物技术崭新的内容，使之成为真正的高技术领域现代生物技术。它促使工农业生产和医疗卫生事业发生了革命性的变化，特别是用于医疗卫生事业的医药生物技术的发展，使疾病的治疗和诊断、药物的研究和生产以及其他卫生保健事业出现了崭新的局面。其中最成功的是生物技术用于新型药物的研制，已有近30种基因工程药物投放市场，产生了巨大的社会效益和经济效益，对新药的研制、开发以及未来医药工业结构调整产生重大影响。21世纪是生命科学的世纪，21世纪是新材料和先进制造技术迅速发展和广泛应用的时代，21世纪

3、是高效、洁净和安全利用新原料的时代，21世纪是人类向空间、海洋、地球内部不断拓展的世纪，21世纪是自然科学发生重大变革、取得突破性进展的时代。医药工业则被誉为21世纪的“朝阳产业”，特别是现代生物技术的迅速发展，更促进了当今世界制药工业的迅猛发展。科学技术的发展、新技术的不断涌现对我国这样的发展中国家来说，既是挑战，也是机遇，而能否抓住发展机遇关键在于提高全民族的科学文化水平，造就一支具有科学精神、懂得科学方法、具有知识创新和技术创新能力的高素质劳动者队伍。所以，发展和普及科学知识、弘扬科学精神、提倡科学方法是我们应对世纪挑战的首要策略。为此，1999年8月，江总书记在视察中国科学院大连化学物

4、理研究所时进一步强调了科普工作者的重要性：“在加强科技进步和创新的同时，我们应该大力加强全社会的科学普及工作，努力提高全民族的科学文化素质。这项工作做好了，就可以为科技进步和创新提供广泛的群众基础。”所以我们应加速现代生物技术制药的人才培养，以迎接21世纪的挑战。生物药物包括从动物、植物、微生物、人和各种海洋生物中制取的以及运用现代生物技术产生的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。它在医疗上具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小疗效可靠及营养价值高等鲜明、显著的特点，已越来越受到人们的青睐和重视。而近半个世纪生命科学的飞速发展给生物药物的开发和利用赋予新的生命，使生物

5、药物成为当今发展最快、影响最大的药物之一。本书着重介绍生物技术制药过程中涉及的重要方法和技术，可根据时间和要求情况，选用部分实验。每个实验后面都附有相关的思考题，书后编有附录，可供读者查阅。王金华 主编 2003年12月于昆明实验一 生物药物原料的选择、处理与保存一、目的要求了解各种不同生物药物原料的来源，学习并掌握各种原料的选择原则、处理及保存方法。二、基本原理生物药物原料以天然的生物材料为主，包括人体、动物、植物、微生物和各种海洋生物等。生物药物的提取与分离方法因为原材料、药物的种类和性质的不同而有很大差异。因此在选择时应注意选择有效成分含量高、原料新鲜、来源丰富、杂质含量少的原料，还要选

6、择最佳采集时间。原料的处理依原料种类的不同而不同。动物原料采集后要立即处理，去处结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；植物原料确定后，要择时采集并就地去除不用的部分，将有用部分干燥、保鲜处理；微生物原料收集时，要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。原料的保存方法主要有三种：冷冻法、有机溶剂脱水法和防腐剂保鲜法。本实验着重介绍有机溶剂脱水法。有机溶剂脱水法：植物、动物组织中常含有较多的脂肪和微生物，该类物质 不仅容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品收率。因此将动、植物原料置于脂溶性有机溶剂（如丙酮、乙醚）中进行脱脂、脱水，制成丙酮干粉，长期保存。三、器材剪刀，研钵，离心机，

7、表面皿，冰箱冷丙酮四、操作步骤1、取植物组织（芹菜叶片）适量（10-20g），用水洗净，甩干；2、用剪刀将之剪碎，放入研钵，加入5v的冷丙酮，研磨成浆糊状；3、将浆糊状研磨物倒入50ml离心管，-20，静置30min；4、取出，于4，4000rpm，离心20min；5、倒去上清液，将沉淀拨至表面皿中，室温自然风干，制成丙酮干粉，4可长期保存。五、实验报告思考题：1、各种不同生物药物原料的选择原则是什么？2、不同生物药物原料的处理及保存方法有哪几种？实验二 包埋法制备固定化细胞一、目的要求了解细胞、酶固定化的方法，掌握固定化细胞、固定化酶的定义和固定化后细胞和酶的性质变化，以及包埋法固定化细胞的

8、方法。二、基本原理固定化细胞主要是利用细胞中的酶类催化小分子的底物进行酶反应。酶反应几乎都是在水溶液中进行的，属于均相反应。均相酶反应系统自然简便，但是也有许多缺点，如溶液中的游离酶只能一次性利用，不仅造成酶的浪费，而且会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量；另外溶液酶很不稳定，溶液变性和失活。如能将酶制剂制成既能保持其原有的催化活性、性能稳定、又不溶于水的固行物，即固定化酶（或固定化细胞），则可像一般固定催化剂那样使用和处理，就可以大大提高酶的利用率。与固定化酶类似，细胞也能固定化。生物细胞虽然属于固相催化剂，但是因为其颗粒微小难于截留或固定，也需要固定化。固定化细胞既有细胞特性和生物催

9、化剂的功能，也具有固相催化剂的特点。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法和无载体法等。包埋法是将细胞定位于凝胶网格内的技术，常用的载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂、明胶和海藻胶。从海藻中提获得的藻酸盐（常为钠盐），是d-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子（如ca2+、al3+）可诱导其形成海藻凝胶。将微生物细胞或酶与藻酸钠溶液混合后，通过注射器针头将上述混合液滴入cacl2溶液中，ca2+从外部扩散进入藻酸钠-细胞混合液珠内，使藻酸钠转变为不溶的藻酸钙凝胶，由此将细胞或酶包埋其中。三、器材10ml注射器，5#针头，烧杯，三角瓶

10、，离心机，磁力搅拌器，玻棒光合细菌，4%海藻酸钠溶液，2.5% cacl2四、操作步骤1、将光合细菌培养液在4000rpm离心20min后，收集菌体于烧杯中，备用；2、向烧杯中的菌体加入等体积的ddh2o，制成稀的悬浮菌液；3、按照1：5的比例将悬浮菌液缓慢倒入4%藻酸钠溶液中，并用玻棒不断搅拌，使之充分混匀；4、用注射器吸取10ml上述菌体-藻酸钠混合液，加上针头，滴入正在进行磁力搅拌的2.5% cacl2溶液中；5、倾去cacl2溶液，用ddh2o冲洗藻酸钙凝胶珠3次，滤干，4备用。五、实验报告思考题：1、藻酸钙凝胶珠为什么呈现均匀的红色？2、固定化细胞、固定化酶的优点有哪些？3、与固定化

11、之前的细胞、酶相比较，固定化细胞、固定化酶的性质有了什么变化？实验三 吸附层析提取鸟巢菌素一、目的要求学习吸附层析的基本原理和方法，掌握硅胶正相吸附层析的基本工艺流程。二、基本原理吸附现象是表面的一个重要性质之一，是指固体表面对气体分子或液体分子的吸着现象，其作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用，如范德华力、静电力、共价结合力以及氢键作用等。吸附色谱就是利用固定相对混合物中不同物质的吸附力不同而使其中的不同组分相互分离的方法。硅胶（silica gel）是常用无机基质层析剂，它的化学成分是二氧化硅，它其实是分子量巨大的无机高分子。用作吸附层析分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅，其

12、特点是表面含有很多硅羟基团（或称硅醇基团），参与各种化学键合和疏水吸附，用于层析。一般认为，硅胶表面的硅羟基团可以有3种不同的类型（图3-1），其中以自由（或孤立）硅羟基对各种键合反应最为重要。图3-1 硅羟基的类型三、器材硅胶（柱层析用），层析柱系统装置，烧杯，玻棒鸟巢菌发酵液，甲醇，氯仿，ddh2o四、操作步骤1、将硅胶用等体积的甲醇溶胀；2、装柱；3、用23v体积的甲醇平衡层析柱，流速2ml/min；4、将浓缩的鸟巢菌发酵液样品上样；5、甲醇-氯仿梯度洗脱，观察洗脱现象；6、收集洗脱样品，2ml/tube；7、将各组分样品于4保存，待检测。五、实验报告1、分析所收集到的各段产物的疏水性强

13、弱。2、了解其他层析介质的性质和分离纯化依据。实验四 液相层析分离、纯化蛋白质类药物一、目的要求学习凝胶过滤层析分离、纯化物质的基本原理和方法，掌握凝胶过滤层析的基本工艺流程。二、基本原理凝胶过滤层析，也称为分子大小排阻层析，是一种根据蛋白质类物质分子的大小和形状来进行分离的方法。与其他类型的层析技术不同，在理想的理论情况下，凝胶过滤不涉及蛋白质与填料（凝胶）之间的吸附或排斥作用。凝胶过滤柱是由均匀装填的多孔凝胶微粒组成，蛋白质是基于不同蛋白质通过这些微孔的迁移能力的不同而被分离的。如果一蛋白质的大小与微孔的大小相比很大，它永远也不会进入这些微孔，在通过层析柱时它就会在凝胶颗粒外面绕行而不是从

14、颗粒内穿行。如果一蛋白质或小分子（如缓冲液的成分）与凝胶过滤填料上的微孔相比很小，这些小分子就会不受阻碍地在凝胶颗粒内穿行，实际上，颗粒对于小分子来说已成了无形之物。因此，大的蛋白质将比小分子更迅速地迁移通过凝郊过滤柱。三、器材sephacryl s-300hr凝胶，吸管，柱色谱分离装置，eppendorf管淀粉酶工程菌株，ddh2o，0.05m naac溶液四、操作步骤1、将sephacryl s-300hr凝胶用0.05m naac-hac缓冲液平衡后，装柱；2、用0.05m naac缓冲液过柱1h，充分平衡层析柱，流速2ml/min；图4-1 柱色谱分离装置图4-2 凝胶色谱分离原理示意

15、图3、将浓缩的淀粉酶工程菌发酵上清液样品上样；4、用0.05m naac缓冲液洗脱；5、收集各洗脱峰样品，收集速率为10sec/tube；6、将各组样品于4保存，待检测。7、层析柱再平衡。五、实验报告1、绘制凝胶色谱分离、纯化不同分子量蛋白质类物质的原理过程图。2、比较凝胶色谱和其他类型色谱的差异。3、凝胶色谱分离出的物质其流出的先后顺序和其分子量大小之间有关系吗？如果有，那么二者关系如何？实验五 半成品药物质量检测蛋白质含量测定一、目的要求学习蛋白质含量测定的方法lowry法的基本原理，并掌握该法的操作。二、基本原理用于蛋白质测定的lowry反应是双缩脲方法的发展，首先是在碱性溶液中形成铜-

16、蛋白质复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（folin试剂），产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在500nm处有最大的吸收峰，颜色深浅（吸收值）与蛋白质浓度成正比，可根据500nm的光吸值大小计算蛋白质的含量。这个测定方法灵敏，但费时。进行测定时，加folin-酚试剂要特别小心，因为folin-酚试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只是在ph10的情况下发生，故当folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。三、器材分光光度计，比色杯，试管，试管架，加样枪，枪头

17、，震荡器，一次性手套，量筒，滤纸，洗瓶0.25mg/ml bsa，4% na2co3，0.8% naoh，1%cuso4，2% 酒石酸钠，folin-酚试剂spss 数据处理软件系统四、操作步骤1、将4% na2co3：0.8% naoh=1：1，制备a液；2、将1%cuso4：2% 酒石酸钠=1：1，制备b液；3、将a：b=50：1，制备c液；4、取0.25mg/ml bsa0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别加入5支试管中，用ddh2o补充至1.0ml；5、取样品1.0ml于另一支试管中；6、向每支试管中加入c液5ml，震荡器混匀，静置10min；7、再向每支试管中加入foli

18、n-酚试剂0.5ml，混匀，静置30min；8、测定od500，ddh2o做对照。9、已光吸值为横坐标，蛋白质浓度（或者含量g）为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。五、实验报告1、绘制标准曲线，用spss软件处理所得数据，并求出回归方程。图5-1 lowry检测法标准曲线2、由标准曲线中的回归方程求得样品中蛋白质浓度，并将浓度单位换算成mg/ml。实验六 蛋白质药物相对分子量测定sds-page一、目的要求了解sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）的基本原理，学习并掌握电泳测定蛋白质分子量的方法。二、基本原理sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）是对蛋白质进行量化，比较及特性

19、鉴定的一种经济、快速，而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。sds与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。sds蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。sds-page因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。图6-1 凝胶电泳原理示意图a电泳开始前 b电泳结束时三、器材垂直凝胶电泳装置，微量加样枪，电泳仪，沸水浴，eppendorf管，摇床丙烯酰胺，n,n-甲叉双丙烯酰胺，tris

20、-base，sds，temed，10%过硫酸铵，-巯基乙醇，甘油，溴酚蓝，甘氨酸，盐酸，dtt，考马斯亮蓝r-250，甲醇，冰乙酸四、操作步骤1、组装凝胶模具，如图6-2所示；图6-2 凝胶模具组装示意图溶液用量(10 ml)a液 2.7mlb液2.5ml蒸馏水4.8ml10%过硫酸铵50ltemed5l 图6-3 用滴管将灌制分离胶 2、灌制分离胶；举例：两块8%的分离胶（6cm8cm0.75cm）小心地将上述凝胶溶液加入模具内，如图6-3所示，等待60min，使凝胶聚合； 溶液用量(4ml)a液0.67mlc液1.0ml蒸馏水2.3ml10%过硫酸铵30ltemed5l3、灌制浓缩胶举例：

21、两块5%的分离胶（6cm8cm 0.75cm）小心地将上述凝胶溶液加入模具内，插入梳子，如图6-4、6-5所示。等待30min，使凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。将电泳缓冲液加入电泳槽；图6-4 将浓缩胶溶液用吸管加入凝胶模具图 6-5 将加样孔梳子插入浓缩胶4、制备样品和上样：样品加入等体积的样品缓冲液，在沸水浴中加热5min，取出，冷却，用微量加样枪加入上样孔中，如图6-6所示；图6-6 将蛋白质样品加入样品孔中5、电泳（200v，100ma，3h）；6、考马斯亮蓝染色（1）染色25min；97.4kd66.2kd 43.0kd 31.0kd 20.1kd 14.4kd1 2

22、3 4 5 6 7 8 9 10 （2）脱色30min。图6-7 蛋白质凝胶电泳结果图2 某发酵原液，1,3-5,9 初纯样品6-8 纯样品，10 protein marker五、实验报告1、以相对迁移率为横坐标，lgmw为纵坐标绘制标准曲线。图6-8 6种标准蛋白质和其他蛋白质凝胶电泳测定的标准曲线2、由该标准曲线，根据迁移率rf，测定样品蛋白质的分子量。3、异常迁移的原因是什么，如何解决？实验七 蛋白质药物纯度检测sds-page一、目的要求了解sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）的基本原理，学习并掌握电泳测定蛋白质纯度的方法。二、基本原理sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-pa

23、ge）是对蛋白质进行特性鉴定的一种经济、快速、可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。sds与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。sds-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。因此可以利用sds-page分析蛋白质混合物的纯度。三、器材同实验六四、操作步骤1、组装凝胶模具；2、灌制分离胶；3、灌制浓缩胶4、制备样品和上样5、电泳（200v，100ma，3h）；6、考马斯亮蓝染色五、实验报告1、根据染色的电泳胶

24、板，分析各泳道样品的纯度。2、如果应该出现单一蛋白质条带的情况下出现了双带，有可能是哪些原因造成的？3、某一样品出现两条带，是否一定代表该样品不纯？为什么？实验八 抗体诊断玻片直接凝集法检测血型一、目的要求学习并掌握抗原抗体凝集反应的原理和方法，了解凝集现象；知道人类abo血型系统的分类。二、基本原理血液制剂是在输血疗法的基础上发展起来的。输血的真正开始应该是从维也纳大学病理解剖学会的青年助理karllandsteiner (18681943)发现血型开始的，1900年他首次发表其研究结果。后来经过其他科学家进行完善，国际联盟卫员会制订并公布了统一的国际命名法，即abo血型系统命名法。abo血

25、型系统 在人类的abo血型系统中，红细胞膜上存在有不同的抗原物质，即凝集原a和凝集原b；与此相对应，血清中则含有特异性抗体，即（或称抗a）凝集素（或称抗b）凝集素。根据红细胞上所含有凝集原种类的不同，可把人类abo血型系统分为四种不同的血型：凡含有凝集原a而血浆中不含有凝集素的血液为a型；凡含有凝集原b而血浆中不含有凝集素的血液为b型；凡无凝集素，而仅含有凝集原a、b的血液为ab型；凡无原a、b凝集原，而仅含有凝集素的血液为o型。当一个人的红细胞同另一个人的血清混合时，有时可看到红细胞彼此凝集在一起，这种现象称为红细胞凝集反应。这种现象正是红细胞表面抗原与血清中相应的抗体相遇时发生的凝集反应。

26、三、器材一次性采血针，酒精棉球，镊子，玻棒，双凹玻片，记号笔标准血清a、b各一盒四、操作步骤1、取双凹玻片一片，左上角写“a”，右上角写“b”，分别加入一滴标准血清a、b；2、采指端血；3、用玻棒两端分别取血少许，分别放入a、b标准血清，混匀；4、静置5min；5、观察。五、实验报告1、绘制人abo血型系统抗原抗体凝集反应图表。（+）阳性反应 （-）阴性反应人红细胞与血清的反应人血清与红细胞的反应解释抗a抗ba细胞b细胞o细胞abo血型2、根据凝集结果确定自己的血型。实验九 单克隆抗体的制备一、目的要求了解单克隆抗体的特性和功能，掌握单克隆抗体的产生机制和制备过程。二、基本原理当动物细胞受到抗

27、原的刺激作用之后，便会在动物体内引起免疫反应，并形成相应的抗体。这种抗原-抗体之间的应答反应是一种相当复杂的过程。由于一种抗原往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一种抗原决定簇又可以被许多种不同的抗体所识别，因此事实上每一种抗原都拥有大量的特异性的识别抗体。单克隆抗体是指由单一的b淋巴细胞克隆产生的，针对一个抗原决定簇的抗体。单克隆抗体的制备方法主要两种：动物体内诱生法和体外培养法。三、试剂及器材1balbc小鼠(成年小鼠或经产母鼠)。2降植烷(pristane，2，6，10，14四甲基五癸烷)或液体石蜡。3杂交瘤细胞：经dmem0培养液离心洗涤1次后，用同样培养液或生理盐水将杂交瘤细胞浓度调为

28、106个ml。离心管(10ml)、吸管、注射器(2ml)、注射针头(7号)、细胞计数板。甩干式转头离心机、显微镜、计数器四、操作方法在接种杂交瘤细胞前，先给小鼠(balbc小鼠)腹腔注射0.5ml降植烷(pristane)或液体石蜡。然后每只小鼠腹腔注射5105106个杂交瘤细胞。接种杂交瘤细胞约710日后，小鼠腹部明显涨大，此时可用左手固定小鼠，用75乙醇消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支试管，将灭菌的注射针头(7号)刺入小鼠下腹部，让腹水滴入管内。 图9-1单克隆抗体的制备过程示意图当腹水停滴时，可轻轻移动针头或轻揉其腹部，使腹水继续滴出。1次可获58ml腹水，间隔23天，待腹水再积累后，同

29、法再取腹水，一般可取腹水23次。收集完腹水后，即以1500rmin离心10分钟，吸取上清液，加入0.02叠氮钠，分装保存于-20。提取纯化抗体（可以采用层析、电泳等方法），并进行必要的特异性检验（酶联免疫法检测）1动物体内诱生单克隆抗体法将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔内，便可诱生腹腔肿瘤和产生含单克隆抗体的小鼠腹水，抗体浓度可达1-10mg/ml，此法尚可有效地保存杂交瘤细胞和分离被杂菌污染的杂交瘤细胞。2体外培养产生单克隆抗体法在实验室条件下，可采用静止培养法，以含10胎牛血清的dmem和2106个ml细胞浓度为最佳培养条件，一般可获10-50gml的单克隆抗体。也可用装有搅拌器或气泡

30、搅拌的发酵罐进行体外大量培养杂交瘤细胞，生产大量单克隆抗体。五、实验报告1、 图示动物体内抗体产生的过程。2、 如何制备单克隆抗体？实验十 植物药物制备技术实验灯盏细辛（erigeron breviscapus）又称灯盏花、双葵花、东菊，为多年生草本菊科植物短葶飞蓬的全草， 主要分布于中国西南地区， 云南各地苗、彝、瑶、壮等少数民族均应用灯盏花入药， 是云南著名中草药。经临床验证， 灯盏细辛对脑血管意外后遗症偏瘫、肢体麻木、口眼歪斜、言语不利等具有良好疗效。现代研究证明， 灯盏细辛能抑制血小板聚集， 促进纤溶活性， 降低血液粘稠度， 改善微循环，增加冠状动脉血流量， 表现了较强的活血化瘀作用。

31、作为从民间挖掘出来的著名民族药， 灯盏细辛的应用从20世纪70年代以来有很大发展， 研制了灯盏细辛注射液、灯盏花胶囊、益脉康片、灯盏花素注射液、灯盏花素片等制剂品种供临床使用。一、 目的要求熟悉植物药物有效成分提取及其制剂制备的工业过程，掌握灯盏细辛的提取、精制方法。二、 实验原理灯盏细辛含植物甾醇、糖甙型鞣质、挥发油、黄酮类、氨基酸、维生素等。所含黄酮类的混合结晶称为灯盏花素，主要成分为黄酮类化合物，易溶于水、易溶于一定浓度的乙醇，提取物中含糖类、糖甙型鞣质（为缩合鞣质，不溶于水）成分较多，所以本实验利用各种成分在水中的溶解度的差异将之分离、去除；另外提取物干燥后吸湿性强，难以形成制剂，本实

32、验采用共同研磨法，以降低吸湿性。三、 实验器材灯盏细辛，120-微晶纤维素（附加剂），可溶性淀粉，羟丙基甲基纤维素（hmcp，崩解剂），65%乙醇uv-721紫外-可见分光光度计，鼓风干燥箱，re-52a旋转蒸发器， 剪刀，1#胶囊壳，研钵，大烧杯，胶囊填充模，一次性塑料手套四、实验步骤1、称取药材全草20g， 剪碎，以65%乙醇100ml浸泡30min，后于90回流1h，将原料瓶过滤，收集滤液于大烧杯中，药渣加入65%乙醇100ml再回流提取2次，每次1h，过滤合并三次所得滤液。2、将滤液在旋转蒸发器中浓缩至干后，加水150ml溶解，充分搅拌后静置3min，过滤，除滤渣（多为鞣质类物质）。3

33、、将所得滤液加热浓缩至稠浸膏，取少量暂存，供含量测定用；其余倒入研钵中（研钵底撒少许淀粉），边倾倒边加入少许淀粉，放入鼓风干燥箱中烤干。4、将干燥浸膏块按4:1的比例加入120-微晶纤维素，研磨成粉，加羟丙基甲基纤维素充分拌匀，得黄褐色干粉，检测其流动性。5、填充胶囊，装量控制在0.3510% g 左右。制备成灯盏细辛胶囊制剂。l 黄酮类化合物定性及定量检测。（一）黄酮的定性检测方法：1、检查黄酮： 取本品稠浸膏2g，加乙醇约16ml，置60水浴上温浸1小时，滤过；取滤液进行下述试验： 取滤液1ml于15ml试管中，加入浓盐酸56滴及少量镁粉，置水浴上加热35min，溶液由黄色逐渐变为红棕色，

34、反应（+）性，证明有黄酮类化合物存在。2、检查灯盏花素：样品制备：同上述项1。同时用灯盏花素乙醇液点样。吸附剂：硅胶（广州化学试剂厂）加1%cmc铺板，在105活化1h。展开剂：丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水（4:5:1:0.5）。展距10cm。显色剂：1%三氯化铝/乙醇溶液。喷雾显深黄色后，105烘3min，在紫外光灯（254nm）下观察，斑点显绿色或亮黄色荧光，反应（+）性，证明有黄酮类化合物存在。（二）黄酮的含量测定方法：1、对照液制备：精确称取120减压干燥至恒重的芦丁对照品200mg，置100ml容量瓶中，加甲醇70ml，置水浴微热溶解，放冷后加甲醇定容。精确吸取10ml于100ml容量瓶

35、中，定容即可。对照品浓度为0.2mg/ml。2、标准曲线制备：（1）分别取对照品0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，置25ml容量瓶中，各加水至6.0ml；（2）加5%亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6min；（3）加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6min；（4）加4.3%naoh溶液10 ml，再加水定容混匀，放置15min；（5）分光光度计检测500nm处吸光度，以浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。 图10-1 标准曲线3、样品测定（1）取样品粗粉1g，60干燥6h，精确称定，置素氏提取器中；（2）加乙醚120 ml，回流至提取液无色，放冷，弃乙醚液；

36、（3）再加甲醇90 ml，回流至提取液无色，移至100 ml容量瓶中，定容；（4）精确量取3 ml，置25 ml容量瓶中，自“加水至6.0 ml”起依照标准曲线制备的方法，测定吸光度。（5）从标准曲线上读出供试品溶液中黄酮含量（质量，g），计算，即可得到百分含量（一般8%）l 另外已知黄酮素在354nm处的吸光系数： e1cm1% = 0.42五、实验报告思考题1、提取过程中乙醇浓度是决定提取物有效成分浓度的关键因素，可以分别用不同的乙醇浓度进行实验，比较产物收率，确定乙醇最佳提取浓度。2、提取物干燥后吸湿性强，在实验中采用共同研磨法，对浸膏粉吸湿性有一定影响。3、如何增强浸膏粉的流动性？4、

37、实验报告说明最后所得物的性状。l 绘制标准曲线，求出所得样品中黄酮含量。实验十一 大蒜细胞sod的提取与分离一、目的要求了解酶类药物的特性和功能，掌握超氧化物歧化酶（sod）的分离机制和提取过程。二、基本原理超氧化物歧化酶（sod）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（o2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2o2-h2o2h2o2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的sod，通过组织或细胞破碎后，可用ph7.8的磷酸缓冲液提取。由于sod不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂，作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国已有

38、产品。由于sod能专一性去除超氧阴离子自由基，故引起国内外生化界和医药界的极大关注。目前临床上应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎，红斑性狼疮，皮肌炎等。三、试剂及器材 （1）新鲜蒜瓣，市售。 （2）大蒜细胞，通过细胞培养技术获得。 （3）磷酸缓冲液：0.05 moll，ph7.8的磷酸缓冲溶液。 （4）氯仿-乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇=3：5。 （5）丙酮：用前冷却至410。 碳酸盐缓冲液：0.05 moll，ph10.2。 edta溶液：0.lmoll。四、操作方法1组织或细胞破碎称取5g大蒜蒜瓣或大蒜细胞，于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。2sod的提取将上述破碎的组织或细胞，加入

39、 23倍体积的0.05 moll ph7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20 min，使sod充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000 rmin下，离心15min，弃沉淀，得提取液。3除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合溶剂搅拌15 min，5000 rmin离心15 min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。4sod的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15 min，5000 rmin离心15min，得 sod沉淀。将sod沉淀溶于0.05 moll ph7.8的磷酸缓冲液中，于5560热处理15min，离心弃沉淀，得到sod酶液。将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的so

40、d活力。试剂及仪器1. ph 8.2 0.05 m tris - hcl 缓冲液(a) 储存液(0.2m tris 溶液) , 24.228g 加纯水至100ml 。(b) 应用液: 250ml 0.2m加0.1n盐酸225ml ,再加水至100ml 。2. 1mm邻苯三酚溶液(a) 储存液(0.1 m) 1.2611g ar级邻苯三酚加纯水至100ml 。(b) 应用液: 1ml 储存液加10ml hc1 至100ml 。3.仪器紫外分光光度计、酸度计、水浴锅、离心机、秒表及常规分析仪器。检测方法：1、取4.5ml ph 8.2 tris - hc1 缓冲液加4.1ml 纯水, 于25 恒温

41、水浴放置20分钟, 加0.1ml 纯水及1mm邻苯三酚0.3ml , 混匀, 紫外分光光度325nm波长处迅速测其自氧化速率,5 分钟内有效,每隔30秒测一次,并记录吸光度,得出邻苯三酚自氧化速率a 值。2、4.5ml ph 8.2 tris - hc1 缓冲注液加4.1ml 纯水, 于25 恒温水浴放置20分钟,加0.1ml sod 酶液及1mm邻苯三酚0.3ml , 混匀,迅速测其吸光度,每隔30秒测一次, 5 分钟内测完,计算得,加sod 后邻苯三酚的自氧化速率b 值。3、活力计算酶活力单位定义: 在一定条件下, 每分钟抑制邻苯三酚在325nm波长处, 自氧化速率达50 %所需酶量定义为

42、一个酶活力单位。五、实验报告思考题1、 提取过程中影响提取物sod有效成分活性的关键因素有哪些？2、 酶类药物制备过程中应该注意什么？如何减轻酶类药物制备过程中不良因素的影响？3、 讨论sod提取过程中遇到的问题及解决方法。4、 计算出大蒜样品中sod的活力。实验十二 动物药物制备实验卵磷脂制备一、实验目的学习脂类药物的制备方法，掌握卵磷脂的提取工艺及制备的原理和工艺。二、实验原理脂类是脂肪、类脂及其衍生物的总称。其共同物理性质是不溶或微溶于水，易溶于某些有机溶剂，在体内以游离或结合的形式存在于组织细胞中，其中具有特定生理药理效应者称为脂类药物。脂类药物分为复合脂类药物及简单脂类药物两大类，复

43、合脂类药物包括与脂肪酸相结合的脂类药物，如卵磷脂及脑磷脂等，简单脂类药物为不含脂肪酸的脂类，如甾体化合物，色素类及coq10等。脂类生化药物种类较多，结构多样化，性质差异很大，制备的方法有如下几种：（一）直接抽提法（二）水解法（三）化学合成或半合成法（四）生物转化法，通常用溶解度法及吸附分离法分离。经分离后的脂类药物中常有微量杂质，需要适当方法精制，常用的方法有结晶法，重结晶法和有机溶剂沉淀法。如用层析分离的pge2经醋酸已烷结晶。磷脂类药物在临床上应用的主要有卵磷脂及脑磷脂，二者都有增强神经组织及调节高级神经活动作用，又是血浆脂肪良好的乳化剂，有促进胆固醇及脂肪运输作用，临床上用于治疗神经衰

44、弱及防止动脉粥样硬化。磷脂类药物中除神经磷脂等少数成分外，其结构中大多含甘油基团，如磷脂酸，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等。1. 卵磷脂的结构2. 卵磷脂性质卵磷脂存在于动物各组织及器官中，脑，精液、肾上腺及红血球含量最多，卵黄中含量高达810，故得名。其在植物中含量很少，唯大豆中含量甚高。为白色蜡状物质，无熔点，有旋光性，在空气中因不饱和脂肪酸烃链氧化而变色。极易溶于乙醚及乙醇，不溶于水，为两性电解质。应用：临床上用于治疗婴儿湿疹、神经衰弱、肝炎、肝硬化及动脉粥样硬化。三、实验器材动物脑干 丙酮 乙醚 乙醇 玻棒回流装置 漏斗 量筒 滤纸 真空干燥箱四、卵磷脂制备（1）工艺路线如图12-1所示。

45、（2）工艺过程1)提取与浓缩 取动物脑干加3倍体积丙酮循环浸提2024h，过滤得滤液分离胆固醇。滤饼蒸去丙酮，加23倍体积乙醇浸提45次，每次过滤的滤饼用于制备脑磷脂。合并滤液，真空浓缩，趁热放出浓缩液。2）沉淀与干燥上述浓缩液冷却至室温，加入半倍体积乙醚，不断搅拌，放置2h，令白色不溶物完全沉淀，过滤，取滤液于激烈搅拌下加入粗卵磷脂重量1.5倍体积的丙酮，析出沉淀，滤除溶剂，得膏状物，以丙酮洗涤两次，真空干燥后得卵磷脂成品。脑干丙酮提取滤液（制取胆固醇原料）滤饼乙醇提取滤饼（制取脑磷脂原料）滤液浓缩浓缩物乙醚溶解滤液丙酮沉淀真空干燥卵磷脂图12-1 卵磷脂的制备工艺路线五、实验报告思考题1、

46、试讨论脂类药物提取过程中的主要影响因素有哪些？应如何减轻其影响？2、讨论卵磷脂提取过程中遇到的问题，试提出相应的解决方法。设计实验十三、分泌抗生素的微生物菌种的选育 一、实验目的：提高同学们对于工业微生物的理论理解及实际动手能力，并且锻炼同学们文献查阅、实验设计及解决实际问题的综合能力。实验体系：从自然界中（土壤或海水中）筛选可以抗大肠杆菌、抗真菌或杀虫的菌株（或提供一株生产菌株，如阿维链霉菌），同学们自己查阅文献，设计实验进行诱变，发酵条件优化，提取。二、需要同学解决的关键问题：1、 筛选标记的选择，如产抗大肠杆菌、抗金黄色葡萄球菌、抗真菌或杀虫抗生素的筛选方法；对于特定抗生素来说，确定其高产菌株的遗传标记。2、 高效诱变方法的选择。3、 发酵条件优化的方法。如营养成份对于产物的影响及理论分析，应用一些新型的统计学方法。4、 抗生素提取、纯化工艺的选择和优化。举例说明：从海水中筛选产抗真菌抗生素的微生物三、实验具体步骤：1、 查找文献确定从海水中分离新的产抗生素的菌株的优势：即海洋是一个特殊的环境，在海洋中生长的微生物必然具有特异的生理生化功能，而从陆地上筛选新