氧载体正十六烷对红法夫酵母发酵产虾青素的影响

1、氧载体正十六烷对红法夫酵母发酵产虾青素的影响王小连 1 , 魏维 2 , 3 , 李秋爽 2 , 徐威 1( 11沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院 ,辽宁 沈阳 110016; 21上海来益生物药物研究开发中心 ,上海 200240;31上海医药工业研究院 ,上海 200240 )摘要 : 目的 考察氧载体正十六烷对红法夫酵母发酵产虾青素的影响 。方法 采用单因素实验法在不同生长时期添加不同浓度正十六烷 。结果 在对数生长期添加体积分数 6 %的正十六烷 ,可使生 物量提高 20114% ,单位细胞虾青素产量从 0169 m gg- 1增加到 0194 m gg- 1 ,说明氧载体的存在使

2、 产物合成能力提高了 35190% 。结论 添加氧载体正十六烷可以加强发酵液中氧传递 ,提高溶氧水 平 ,促进虾青素的单位合成效率 。关键词 : 红法夫酵母 ; 虾青素 ; 氧载体 ; 正十六烷中图分类号 : q 815文献标志码 : a虾青素 ( a staxan th in ) 化学名称 3 , 3 2二羟基 24 , 4 2二酮基 2, 2胡萝卜素 , 又称虾黄质、虾黄 素 ,是一种非维生素 a 源类胡萝卜素 。虾青素广泛分布于自然界尤其是海洋环境中 ,其具有抑制 多不饱和脂肪酸的氧化 、改善视力、抗癌 、提高免疫力、促进色素形成等重要的生物学功能 1 - 3 ,在 医药、保健品、化妆品

3、及饲料等行业有着广阔的应 用前景 。红法夫酵母 ( x an thophy llom yces dend ro2rhous)是一种产虾青素的酵母 , 在其所产的类胡萝卜素中虾青素是主要成分 ,因而被认为是最有 可能实现工业化发酵生产天然虾青素的优良菌种 4 。人们采用了多种方法提高红法夫酵母发 酵产虾青素的产量水平 ,如选育高产虾青素的突变株 ,优化发酵培养基组成 ,添加发酵促进剂和氧载体 5 - 7 等 。作者对多种有机溶剂在红法夫酵母 培养过程中作为氧载体的效果进行了评价和筛选 ,并具体考察了正十六烷添加浓度和添加时间 对细胞生长及虾青素合成的影响 ,经条件优化后虾青素的产量得到了明显地提

4、高 。len t1100 液相色谱仪 (包括 a gilen t1100 系列二元泵 、dad 检测器 、自动进样器 、a gilen t chem 2 sta tion色谱工作站 , 美国 a gilen t公司 ) , a gilen t 液质联用色谱仪 (包括 6110 单四极杆质谱仪 、 大气压电离 2电喷雾电离源 ( a p i2es) 、大气压化 学电 离 源 ( a pc i) 、a gilen t21100 系 列 四 元 泵 、vwd 检测器 、a gilen t chem sta tion 色谱工 作站 ,美国 a gilen t公司 ) 。虾青素标准样品 (美国 sigm

5、 a 公司 ) ,酵母抽 提物 、胰蛋白胨 (英国 o xo id 公司 ) , 麦芽抽提物 (上海源 聚 生 物 科 技 有 限 公 司 ) , 二 甲 基 亚 砜 (dm so ) 、甲醇和氯仿 (分析纯 ) 、葡萄糖等 (国药集团化学试剂有限公司 ) 。112 菌种菌 种 为 x an thophy llom yces dend rorhous hc2cb 30025由上海来益生物药物研究开发中心保 存 。113 培养基ym 培养基 ( gl - 1 ) : 葡萄糖 1010、酵母抽提 物 310、胰蛋白胨 510、麦芽抽提物 310。发酵 培 养 基 ( gl - 1 ) : 葡 萄

6、糖 5010、蔗 糖5010、酵 母 浸 粉 410、( nh4 ) 2 so4 410、kh2 po4110、caco3 115 , ph 610。2 方法1 仪器与材料111 仪器与试剂ph s22c数显型酸度计 (上海宇隆仪器有限公 司 ) , h z22410 kb 恒温摇床 (太仓科教器材厂 ) ,高压蒸 汽 灭 菌 锅 (日 本 h ira yam 公 司 ) , a gi2收稿日期 : 2010203215作者简介 :王小连 ( 19832) ,女 (汉族 ) ,河北石家庄人 ,硕士研究生 , e2m a il w ang tongx i2002 163. com ; 徐威 (

7、19632) ,女 (汉族 ) , 吉林长春人 , 教授 , 主要从事微生物制药及基因工程药物研究 , te l. 024223986400, e2m a il shxuw e i8720 163. com 。沈 阳 药科大 学 学 报第 28卷74211 种子培养将在 ym 斜面已活化 96 h的菌种接种到 液体培养基中 , 25 培养 48 h。212 发酵培养216 生物量测定取发酵液 10 ml , 4 000 rm in - 1离心 10 m in,弃 去 上 清 液 , 用 蒸 馏 水 洗 涤 菌 体 3 次 ,4 000 rm in - 1离心弃上清液 , 105 下烘干至质 量

8、恒定。217 单位干细胞虾青素产量根据得到的生物量 、虾青素产量计算得到单 位干细胞中红法夫酵母胞内虾青素产量 (虾青素 单产 ) ,计算公式如下 :ym将种子培养物以体积分数 12 %接种量接入含有氧载体的发酵培养基 ( 250 ml 三角瓶 ,每瓶 装量 25 ml )中 ,于 25 、220 rm in - 1培养 6 d。213 色谱条件采用 h plc 法 。色谱柱 : d iamon siltm (钻石 )tm虾青素产量 (m gl - 1 )c18柱 ( 200 mm 416 mm , 5 m ) 、d iamon sil (钻石 ) c18保护柱 ( 211 mm 10 mm

9、, 5 m ) ,流动相 :乙腈 2四 氢 呋 喃 (体 积 比 为 90 10 ) , 流 速 :110 mlm in - 1 ,柱温 : 25 。214 质谱条件离子源为大气压电离源 (a pc i) ,雾化气压力 为 41317 kpa,干燥气温度为 350 ,干燥气流速6 lm in - 1 ,蒸发室气化温度 350 ,毛细管电压 2000 v ,电流 4 a ,正离子方式检测 ,扫描方式为 全扫描相对分子质量范围为 200 800 ,用于定性 分析的离子分别为 m / z 59718 (虾青素 ) 和 m / z56514 ( 3 , 4 2d idehyd ro23 2hyd ro

10、xy2, 2ca ro ten24 2one, hdco ) 。215 发酵样品的处理取出发酵液 2 ml ,加入 5 ml 预热到 55 的dm so ,再加入甲醇 2 ml 和氯仿 1 ml ,混匀 。于55 水浴 15 m in, 4 000 rm in - 1离心 10 m in,取出 上清液 ,即为待分析的样品 。虾青素单产 (m gg- 1 ) =- 1 )生物量 ( gl3 结果311 虾青素标准曲线的建立称取一定量虾青素标准品 ,用氯仿配制成质 量浓度为 100 m gl - 1的标准储备液 ,用乙腈 2四氢 呋喃 (体积比为 90 10 )的混合溶剂稀释成质量浓度分别为 11

11、0、210、510、1010、2010 m gl - 1标准工 作液 。将一系列虾青素标准工作液按“213 ”条色 谱条件分别进样 3 次 , 以虾青素的质量浓度 (, m gl - 1 )为横坐标 ,相应的峰面积 (a )为纵坐标进 行线性回归 , 得到的回归方程为 a = 27315-104187 , r = 01999 4。虾 青 素 质 量 浓 度 在 0 20 m gl - 1内与峰面积呈良好的线性关系。312 主要产物分析对本实验菌种的发酵样品进行高效液相色 谱 2质谱分析 ,结果见图 1。a h plc of a staxan th in standa rd; b h plc o

12、f fe rm en ta tion extrac ts; c and d m s of fe rm en ta tion extrac ts;2 hdco1a staxan th in;f ig. 1 l c 2m s ana ly s is of ferm en ta t ion ex tra c ts ex tra c ted from x a n th oph yllom yces den d ro rh ou s 1994-2013 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. htt

13、p:/第 1期王小连等 :氧载体正十六烷对红法夫酵母发酵产虾青素的影响75十六烷作为待测氧载体 ,分别用 0122 m 滤膜过滤除菌。筛选氧载体试验中 ,在接种的同时分别 添加体积分数 1 % 、4 %和 10 %的氧载体 。取样测 定细胞生物量和虾青素产量 ,并计算得到虾青素单产 ,结果见表 1。在实验条件下该菌种发酵的主要类胡萝卜素为虾青 素 ( m / z 59718 ) , 产 量 其 次 为 hdco ( m / z56514) ,这两种产物约占总类胡萝卜素质量的 80%。313 不同氧载体的添加试验选择 tween280、油酸 、正庚烷、正十二烷和正ta b

14、 le 1 effec ts of d ifferen t organ ic so lven t a s an oxygen 2vec tor in x a n th oph yllom yces den d ro rh ou s ferm en ta t ion/ %( b iom a ss) / ( gl - 1 )c ( a staxan th in yie ld) / (m gg- 1 )o rgan ic so lven tdodecane0141001410014100141001410161211611712109517716121151471613614112161211110

15、9101341010216121111451123017916121131630182010001690171016101550169017101770165016901630161014301690168014401250169016401210100n2h exadecanetween280o le icac idn2h ep tane由表 1 可以看出 , 体积分数为 1 %的正十二烷能提高虾青素产量 ,而对红法夫酵母生长没有 影响。正十六烷在体积分数 1 %和 4 %时均能提 高虾青素产量 ,而且对红法夫酵母生长和虾青素 的合成提高作用更为明显。添加体积分数 4 %有加入正十六烷的作为

16、对照 ,培养 6 d 后测定发酵各参数。结果见表 2。ta b le 2 effec ts of d ifferen t con cen tra t ion of n 2hexa de2can e a dd it ion on the a sta xan th in produc t ion ( n2h exadecane) /%( b iom a ss) /c ( a staxan th in yie ld) /- 1 )- 1 )( glm gg(16136 gl - 1 和16121 gl - 1 和时 ,生物量和虾青素单产达到0177 m gg- 1 ,而对照组分别为161971614

17、5161791912616129141121316301700172017701940175016601610246810120169 m gg- 1 。添加体积分数 1 %的 tween280、油酸、正庚烷抑制菌体生长 , 添加体积分数 4 %和10 %时严重抑制菌体生长和虾青素的合成。说明 这些有机溶剂对红法夫酵母细胞的刺激或者毒性 很大 ,生物相容性不好。314 添加正十六烷对红法夫酵母发酵的影响考察加入不同体积分数的正十六烷对红法夫 酵母生长和虾青素合成的影响。在发酵培养基的基础上 ,在发酵初始阶段 0 h 添加体积分数为2 % 、4 % 、6 % 、8 % 、10 % 、12 %的正

18、十六烷 ,并以没由表 2可以看出 ,加入正十六烷对红法夫酵母虾青素的合成存在较明显的影响 ,最佳添加量 是三角瓶中培养基体积的 6 %添加 ,超过 8 %时 , 生物量和虾青素产量均有所下降。这可能是因为 1994-2013 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 沈 阳 药 科大 学 学 报第 28卷76增加到 0194 m gg- 1 ,合成能力提高了 35190 % 。在接种后 120 h再添加体积分数 6 %的正十六烷 不能促进红法夫酵母的生长和

19、代谢 ,甚至有抑制 作用 。因此 ,最佳应用条件是在接种 24 h (对数生长期 ) 同时添加体积分数 6 %的正十六烷。由 于红法夫酵母在摇瓶培养时耗氧速率很快 ,而菌 体生长对数期对氧的需求更强烈 ,此时培养液中 溶氧低于临界溶氧浓度 , 成为培养的限制因素。 在对数生长期添加正十六烷对发酵的效果更好 ,就是因为加入的氧载体可以及时缓解该期出现的 供氧不足问题 。而在细胞处于代谢旺盛的发酵期 添加正十六烷会使生物量和虾青素产量有所降 低 ,可能是因为正十六烷的有机溶剂毒性超过了 其作为氧载体促进溶氧的能力。所以合适浓度的氧载体在最适的时间添加才能更有效的促进红法 夫酵母合成虾青素。较高浓度

20、的有机溶剂对细胞产生了明显的抑制作用 ,或者是由于表观黏度的不断增加影响了氧传 质系数。与未加正十六烷的对照组相比 ,生物量 由 16197 gl - 1增加到 19126 gl - 1 (加入体积分 数 6 %正十六烷 ) ; 虾青素单产由 0170 m gg- 1 增 加到 0194 m gg- 1 ;分别提高 13148 %和 34153 % 。 结果表明 ,添加氧载体提高了发酵液的溶氧水平 , 进而促进了红法夫酵母合成虾青素的能力。虾青 素产量的增加 ,不仅是因为提高了生物量 ,单位细 胞合成能力明显增强也是主要原因 。发酵初始阶段 0 h 添加体积分数 6 %的正十 六烷 ,在 0、

21、24、48、72、96、120、144、169 h 取样测 定各发酵参数 ,以没有加入正十六烷的作为对照 组 ,结果见图 2。 b iom a ss / n2hexadecane; b iom a ss / con tro l; a staxan th in yie ld / n 2hexadecane; a staxan th in yie ld / con2tro lf ig. 2 effec ts of n 2hexa decan e a dd it ion on b iom a ss an d a sta xan th in y ie ld添加体积分数 6 %的正十六烷实验组与对照组相

22、比 ,生物量的变化趋势没有明显区别 ,菌体生 长都集中在 2496 h,生物量在 24 h后开始明显高于对照组 。添加正十六烷的实验组虾青素代谢主要在 48 144 h,而对照组在 48 120 h,实验组 虾青素单产在 48 h后高于对照组 ,并且随着发酵 时间延长增长的幅度增大 ,到达菌体代谢稳定期 时不再变化 。315 正十六烷添加时间对红法夫酵母发酵的影响 分别在接种同时 ( 0 h)和接种后 24、48、120 h 添加体积分数 6 %的正十六烷 ,发酵 6 d后检测各参数 ,结果见图 3。在接种的 48 h内添加体积分数 6 %的正十六 烷 ,均能提高红法夫酵母的生物量和虾青素产量

23、 ,但以接种后 24 h添加体积分数 6 %的正十六烷效 果最好 ,生物量达到 20151 gl - 1 ,比对照组增加了 20114 % ,单位细胞虾青素产量从 0169 m gg- 1 b iom a ss; a staxan th in yie ldf ig. 3 effec ts of a dd in g t im e of n 2hexa decan e on b io2m a ss an d a sta xan th in y ie ld4 讨论红法夫酵母属于好氧型菌株 ,有研究表明 ,氧 在红法夫酵母生物合成类胡萝卜素的反应中起着 至关重要的作用 8 - 9 。提高搅拌速度和增大

24、通气 量可以增加氧的供给 ,但造成能源过量消耗 ,同时 产生很大剪切力 ,因此 ,研究有效的供氧方式十分 必要 。通过在发酵液中引入一种新的液相以减少 气液传氧阻力 、提高传氧效率是传氧技术的主要 发展方向之一 。这种液相一般具有比水更高的溶 氧能力 ,且与发酵液互不相溶 ,称为氧载体 ( oxy2 gen2vec to r) 。通常使用的氧载体主要有 : 液态烷 烃 、油酸 、甲苯 、全氟化碳、豆油等。强化发酵过程中的氧传递 ,主要来自两个方 面 :一方面是氧在氧载体中的溶解度大大高于氧 在水中的溶解度 ,比如在正十六烷中的溶解度就 比在水中的高 8 倍 10 ;另一方面是由于氧载体在 19

25、94-2013 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 第 1期王小连等 :氧载体正十六烷对红法夫酵母发酵产虾青素的影响77培养基中的分散 、乳化 ,增大了氧传递的相面积 ,从而大大提高了氧的体积传递系数 ,有利于氧传 递 11 。正十二烷、正十六烷是常用的液态烷烃类 氧载体 12 - 13 ,其铺展系数为正值 ,氧在其中有更高的溶解度 。梁新乐等发现正十二烷添加能提高 虾青素的产量 7 ,刘元帅等将正十六烷添加到红 法夫酵母发酵培养基中 14 ,得出最

26、佳应用条件是 在接种同时添加体积分数 10 %的正十六烷 ,使红 法夫 酵 母 单 位 类 胡 萝 卜 素 合 成 能 力 提 高 了18100 % 。作者首先对多种有机溶剂作为氧载体 的效果进行了评价和筛选 ,发现正十二烷对虾青 素合成的促进效果不如正十六烷 。接着在正十六 烷添加体积分数和时间上进一步细化 ,结果显示 对数生长期同时添加体积分数 6 %的正十六烷可以使干细胞中红法夫酵母胞内虾青素产量提高35190 % 。因此 ,添加氧载体能加强发酵液中氧传 递 ,提高溶氧水平 ,从而大大促进虾青素的单位合 成效率。同时 ,选择氧载体时要根据菌种的特异 性选择合适的种类和条件 ,这样才能达到

27、提高虾 青素产量的目的。370. 6 梁新乐 ,励建荣 , 陈敏 , 等. 氧载体强化氧传递促进 法夫酵母虾青素的合成 j . 菌物系统 , 2003 , 22 ( 3 ) : 424 - 429. 7 梁新乐 ,励建荣 ,张虹. 正十二烷强化氧传递促进法夫酵母虾青素的合成 j . 菌物系统 , 2004 , 23 ( 4 ) :524 - 528. 8 r eynd er m b , rawl in gs d e, harr ison s t l.d emon stra tion of the c rab tree effec t in phaff ia rhodozy2 m a du ri

28、ng con tinuou s and fed2ba tch cu ltiva tion j . b i2 o techno logy l e tte rs, 1997, 19 ( 6) : 549 - 552. 9 w ill iam a s, john son e a. single t oxygen and p e roxyl rad ica ls regu la te ca ro teno id b io syn the sis in phaff ia rhodozym a j . j b io chem , 1995, 270:18374 - 18379. 10 ho c s, ju

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30、 in fe rm en ta tion u sing em u lsified oxygen2vec to rs j . b io techno logy and b io2 enginee ring, 1990, 35 ( 4) : 427 - 435.galact ion a i, dan c, corn el iu o , e t a l. en2 hancem en t of oxygen m a ss tran sfe r in stirred b io reac2 to rs u sing oxygen2vec to rs. 1. sim u la ted fe rm en ta

31、 tion b ro th s j . b iop roce ss and b io system s enginee ring,2004 , 26 ( 4 ) : 231 - 238. 11 参考文献 : 12 1 刘子贻 ,沈奇桂. 虾青素的生物活性及开发应用前景 j . 中国海洋药物杂志 , 1997, 63 ( 3) : 46 - 49. 2 彭小兰. 虾青素的生理功能及其生产与应用研究 j . 当代畜牧 , 2005 ( 11 ) : 50 - 52. 3 綦秀芬 , 李恩泽 , 刘月芬 , 等. 虾青素的研究进展 j . 齐鲁医学杂志 , 2003, 18 ( 3) : 354 -

32、 355. 4 卢宝驹 ,肖安风 , 李利君 , 等. 高温湿热酸法破壁提 取法夫酵母胞内虾青素 j . 生物工程学报 , 2008,24 ( 7 ) : 1285 - 1292. 5 汪洪涛 ,徐学明 ,金征宇. 法夫酵母产虾青素发酵促 进剂的研究 j . 江苏农业科学 , 2006 ( 6 ) : 368 - 13 l iu y s, wu j y. u se of n 2hexadecane a s an oxygen vec to r to imp rove phaff ia rhodozym a grow th and ca ro te2 no id p roduc tion in

33、shake2fla sk cu ltu re s j . jou rna l of app lied m ic rob io logy, 2006, 101 ( 5) : 1033 - 1038. 14 刘元帅 ,石国领 ,吴建勇. 添加液态烷烃氧载体对法夫酵母发酵生产虾青素的影响 j . 食品与发酵工 业 , 2005 , 31 ( 6 ) : 43 - 46.(下转至第 86页 ) 1994-2013 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 沈 阳

34、药 科大 学 学 报第 28卷86 36 zhan g w e i2fen, ch en x i2guang, l i p i2wu, e t a l. ch2ito san and ch ito san /2cyc lodextrin m ic ro sp he re s a s su sta ined2re lea se d rug ca rrie rs j . j app l phys, 2007,103 ( 22 ) : 1183 - 1190. 37 杨小玲 ,李仲谨 ,陈佑宁 ,等. 复合淀粉微球的合成与表征 j . 食品与生物技术学报 , 2008, 27 ( 4 ) :63 -

35、 65.progre ss onthe appl ica tion s of cyc lodextr in anditsder iva t ive s in m icrosphere szhan g j uan, zha n g l i(d ep a r tm en t of p reven tive m ed ic ine, m ed ica l c o llege of c h inese p eop le s a rm ed p o lice f o rce, tia n jin300162, c h ina )a b stra c t: o b jec t ive to sum m a

36、 rize the p rog ress on the app lica tions of cyc lodex trin and its de riva tives in m i2c rosp he res. m e thod s a cco rd ing to 37 a rtic les f rom the lite ra tu re re trieva l resu lts, th is rev iew w as to exp ound recen t p ha rm aceu tica l app lica tions of cd and its de riva tives in the

37、 ir u tilities as ca rrie r m a te ria ls fo r m ic ro2 sp he res, p o re 2c rea ting agen ts, su rface trea tm en t agen ts, d isp e rs ion s tab ilize r, and the ir im p rovem en ts in the p rop e rties of d rug in m ic rosp he res w e re rev iew ed. re su lts c yc lodex trin and its de riva tives

38、 w e re effec tive ad2 juvan ts in p rep a ring m ic rosp he res and im p rov ing the ir p rop e rties. c on c lu s ion s the f ind ing sugges ts a sa tis2 fac to ry p rosp ec t of cyc lodex trin and its de riva tives in resea rch and p rep a ra tion of new dosage fo rm s.key word s: cyc lodextrin;

39、cyc lodextrin de riva tive s; m ic ro sp he re s(上接第 77 页 )influence s of n 2hexadecan e on produc in g a staxan th inbyferm en ta t ionxa n th oph yllom ycesden d ro rh ou sm e thodw a n g x iao 2lian1 , w e i w e i2, 3 , l i q iu 2shuang2 , xu w e i1( 1. s choo l of l ife sc ience a nd b iop ha rm a ceu tics, shenya ng p ha rm a ceu tica l u n ive rs ity, shenya ng 110016, c h ina; 2. s ha ngha i h ea