临床微生物实用手册

1、临床微生物实用手册（内部资料）试剂配制1、革兰氏染液甲液：结晶紫：1.25g 95酒精：50ml dh2o：450ml乙液：na2co3：6.25g dh2o：500ml碱性碘液：i2：6.0g ki：12.0g naoh（1mol/l）：270ml 待ki完全溶于dh2o，后，再加i2丙酮酒精液： 95酒精：70ml 丙酮： 30ml碱性复红水溶液： 碱性复红：8g 95%酒精：100l dh2o：900m2、抗酸染液（萋尼）1石炭酸复红染液：（1）储存液 碱性复红液：碱性复红8g，加95%乙醇至100ml，充分振荡使复红溶解。 5%石炭酸水溶液：4050水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸

2、5g 溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml。（2）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml 与5%石炭酸水溶液90ml充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。25%盐酸乙醇脱色液：35%浓盐酸5ml 与95%乙醇95ml 混合。3亚甲蓝复染液：（1）储存液：亚甲蓝0.3g 溶于95%乙醇50ml 中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。（2）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5 倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06%，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。3、甲基红试剂甲基红：0.2g 95酒精：300ml dh2o：200

3、ml配制：将甲基红称入乳钵内，加1mol/l naoh 10ml左右（提高甲基红溶解度），碾磨，加入酒精300ml dh2o 180ml，混匀后，再加入1 mol/l hcl 10ml左右，中和其中的naoh，最后试剂弱带酸性4、靛基质试剂 对二甲氨基苯甲醛:5.0g 纯戊醇或正丁醇:75ml 浓盐酸:25ml配制：浓盐酸要待对二甲氨基苯甲醛溶解于纯戊醇后，再一滴滴徐徐加入5、伏波（vp）试剂甲液：a萘酚：6.0g 无水乙醇： 100ml 乙液：koh：40g 肌酸：0.3g dh2o: 100ml注：甲液应储存于棕色瓶中5、100g/l去氧胆酸钠溶液 去氧胆酸钠：5g 0.1 mol/l n

4、aoh：5ml 溶解后加dh2o 45ml于冰箱可保存半月有效。6、氧化酶，细胞色素氧化酶10g/l盐酸二甲基对苯二胺（或）四甲基对苯二胺）水溶液10g/l a萘酚乙醇液7、硝酸盐还原试剂甲液：对氨基苯磺酸：0.8g 5mol/l醋酸：100ml乙液： a萘胺：0.5g 5mol/l醋酸：100ml8、6g/l酚红指示剂酚红：3g 1mol/l naoh：10ml 1mol/l hcl：10ml dh2o：480ml配制：将酚红放入乳钵内加naoh研磨，加dh2o 280ml，无水乙醇200ml混匀后，加入hcl混匀。配好后液体应为透明橙红色。染色1、革兰氏染色法试剂：结晶紫 碳酸钠溶液 碱性

5、碘液 丙酮酸酒精碱性复红水溶液方法：1.将标本均匀涂布于洁净玻片上，自然干燥，火焰微热固定2.滴加结晶紫（革兰甲液）和碳酸钠液（革兰乙液）各2滴，初染30秒钟，水洗。3.用碱性碘液2滴固定30秒钟，水洗4.用丙酮酸酒精脱色至无兰色脱落为止（约510秒），水洗。5.用碱性复红水溶液复染5秒钟，水洗待干镜检。结果：革兰氏染色阴性细菌在视野下呈淡红色。革兰氏阳性细菌呈深紫色注意事项：1.涂片应均匀，厚薄适宜，应自然干燥后再加微热固定。以热而不烫手为易，过热易使细菌变形。2.脱色要至无兰色脱落为止。3.复染时间不可过长，以免细菌均染成g菌。4.枯草杆菌，链球菌有时染成紫红色，是因为细菌繁殖代谢中有紫色

6、嗜变性，不一定全是染色原因，所以要根据其菌体形态加以确定。2、抗酸杆菌染色试剂：石碳酸复红溶液 盐酸酒精溶液 碱性美兰溶液方法：1.加满石碳酸复红溶液在已固定德标本玻片上，加温23分钟，使染液即有蒸汽上升又不致沸腾，不时添加染液，以免在受热情况下干凅。2.倾出染液，以dh2o冲洗后用盐酸酒精溶液脱色，直至玻片无红色为止。3.dh2o冲洗，用碱性美兰复染1分钟。4.dh2o冲洗，待干镜检。结果：抗酸杆菌被染成红色，背景为兰色。结核、麻风杆菌为抗酸阳性（奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性）3、庞氏染色法试剂：庞氏染液方法：涂片经自然干燥后经火焰固定，滴加庞氏染液2滴，静染35分钟后，水洗，待干镜检。结果：

7、双级体杆菌菌体呈淡兰色两端级体呈深紫兰色报告：查见双级体杆菌或未查见白喉杆菌4、墨汁染色查新型隐球菌试剂：优质印度墨汁方法：取一滴优质印度墨汁或国产优质墨汁于洁净载玻片上，加入待检标本（液体标本需离心后取沉淀）一滴，与之混合，加盖玻片于底倍镜下，将出光调暗，观察菌体及其周围荚膜。阴性结果：在高倍镜下可见黑色背景中透明宽厚的荚膜，似晕轮，有较厚的细胞膜，有时可见生芽的。内有脂质颗粒析出。注意：要与白细胞区别。白细胞无芽出现象、无荚膜、细胞壁薄、无脂质颗粒析出。5、细菌细胞壁染色法用途：观察细菌细胞壁是否缺损试剂：甲液：100g/l鞣酸水溶液 乙液：5g/l龙胆紫方法：用无菌生理盐水涂片，将细菌均

8、匀涂布于玻片上，待其自然干燥后，滴加甲液固定15分钟，水洗，滴加乙液染色3分钟，水洗，自然干燥待检。结果：有细胞壁的细菌，周边染成紫色，内部无色，缺壁细菌染料可进入菌体，菌体被染成深紫色。注意事项：1.所用菌种必须是新分离所得菌2.涂片需自然干燥，切勿在火焰上固定6、鞭毛申云氏法（水法）试剂： 200g/l鞣酸 200g/l钾明矾 1：12饱和石碳酸碱性复红酒精液应用液：取1，2，3，4液个2ml，2ml，5ml，1.5ml混匀,用滤纸过滤后备用方法：1.“训练”菌种：将菌种接种于软琼脂平皿中央（点种），37 24h后取平板边缘扩散菌，再转软琼脂。反复几次（视情况而定）。2.取一洁净玻片，置于

9、桌面，垫高一端，是与桌面呈15o角左右，用洁净滴管在玻片中央滴加一滴蒸馏水，用滴管顺玻片将液滴摸成卵圆形。3.用接种环挑取一定量平板边缘菌，轻轻乳化于玻片高的一端的液滴边缘，让其自然往下流动5分钟左右。4.轻轻将玻片放平，滴加与液滴同等量的应用，染色5分钟,用水沿一端（最好是从高的一端）轻轻冲洗，待干镜检。结果：菌体呈深紫红色鞭毛呈淡紫红色注意事项：1.所用应用液必须新鲜配制，以配制后23天内使用为宜。所用器皿，特别是玻片必须洁净。2.所用代测菌应使用多次反复转种软琼脂后的新鲜菌种3.方法中3项的时间要严格掌握，此步的原理是用蒸馏水：这种低渗液渗入菌体内，使菌体，鞭毛都发生不同程度的膨胀，时间

10、太长菌体易裂正确选择需要鉴定的细菌1、血培养：主要病原菌：沙门菌，布氏杆菌，其它革兰阴性杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌以下菌应视为非致病菌（除非1次血培养分离出）：芽孢杆菌属，凝固酶阴性葡萄球菌，草绿色链球菌，棒状革兰阳性杆菌2、脑脊液培养：主要病原菌：b群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌3、咽部标本培养（上呼吸道标本）：主要病原菌：a群溶血链球菌选择性报告：溶血隐秘杆菌咽炎中非致病菌：金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌，溶血链球菌，所有革兰阴性杆菌，所有酵母菌4、痰标本（下呼吸道标本）主要病原菌：肺炎链球菌，克

11、雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌5、尿培养主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其它革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金黄色葡萄球菌6、生殖道标本培养：主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌，女性细菌性阴道病综合征，孕妇携带的b群溶血链球菌非病原菌：金黄色葡萄球菌，任何革兰阴性杆菌（包括大肠杆菌，变形杆菌），b群溶血链球菌（仅为孕妇报告）生殖道标本（女）：阴道高位拭子：酵母菌，阴道毛滴虫，细菌性阴道感染宫颈或宫颈内部：淋病奈瑟菌，沙眼衣原体，人乳头瘤病毒肛门或直肠拭子：淋病奈瑟菌，b群链球菌（+阴道拭子）7、脓，吸

12、取物或组织标本:主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，其它溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其它革兰阴性杆菌非致病菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量棒状革兰阳性杆菌8、抽吸物组织标本的厌氧培养：主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，其它溶血链球菌，铜绿假单胞，其它革兰阴性杆菌，梭状芽孢杆菌，梭菌属，拟杆菌属，其它厌氧菌非致病菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量棒状革兰阳性杆菌9、粪便培养：主要病原菌：沙门菌，志贺菌，弯曲杆菌，霍乱弧菌，副溶血弧菌，产毒性大肠杆菌，难辨梭菌（常规实验室检测不出）常用的细菌鉴定链球菌科（链球菌属和肠球菌属）的鉴定索引 gpc（椭圆，呈双、短链、长链） 触酶（-） 溶血 溶血 溶

13、血菌落、菌体特征 胆汁七叶苷 胆汁溶菌试验 杆菌肽 camp 七叶苷 - +optochin（5ug） s 黄色素 + 草链 d群 a链 马尿酸钠 胆汁七叶苷 6.5%nacls(溶菌,15) r +肺链 胆汁七叶苷 b链 + - + - - - d群 g链 肠球菌属 d链 草绿链球菌群 d群 阿拉伯糖 甘露醇 山梨醇 乳糖 马尿酸钠 粪肠球菌 - + + + + 屎肠球菌 + + - + - 鸟肠球菌 - + + + - 坚韧肠球菌 - - - + -微球菌科细菌的鉴定索引 gpc（圆形，呈葡萄、双、四联状） + 触酶 - 微球菌科 链球菌科菌落、菌体特征葡萄糖发酵 - + 四联球菌 葡萄球

14、菌属 玻片法血浆凝固酶 + - 金黄色葡萄球菌 试管法血浆凝固酶 甘露醇发酵 + - 新生霉素（16mm s） 尿素 麦芽糖发酵 表葡 腐葡 溶葡 新 s r s 尿 + + -麦 + + +特殊细菌特点：产单核李斯特菌：主要存在于脑脊液和血中的病原菌规则的革兰阳性杆菌，长短不一，溶血但溶血环不超过菌落边缘，触酶阳性，26有动力，35无动力芽孢杆菌属：（主要病原菌：炭疽芽胞杆菌）规则革兰阳性杆菌&芽孢（不着色）可能炭疽芽胞杆菌：生长迅速，不溶血，菌落粘在一起，无动力伤寒沙门氏菌标本采集：未使用抗生素前提下第一周分离阳性血液90%粪便10%第三周分离阳性血液50%粪便85%尿25%使用抗生素后：

15、骨髓，玫瑰疹药物敏感性超广谱-内酰胺酶（esbls）：克雷伯菌属，大肠艾希氏，特点：质粒编码，非边界耐药（青霉素类，头孢菌素，氨曲南）；通常对抑制剂（棒酸、他巴唑、他唑巴坦）敏感。治疗用药：碳青酶烯、抑制剂复合类或头霉素ampc -内酰胺酶：肠杆菌属，枸橼酸杆菌属，特点：染色体、质粒编码，诱导酶，非边界耐药（青霉素类，头孢菌素1，2，3代，头霉素）对抑制剂不敏感。治疗用药：碳青酶烯，头孢4代抗生素：青霉素类抗生素天然青霉素：青霉素g 青霉素v 不产青霉素酶的g+球菌和g-球菌 耐青霉素酶青霉素：苯唑西林 氯唑西林 奈夫西林 氟氯西林 产青霉素酶的g+菌和g-球菌作用机制青霉素类抗生素作用于细胞

16、壁合成后阶段的酶 阻断肽聚糖合成的最后阶段肽聚糖链的组装和三维结构的构建。 该阶段由下面几种酶催化完成： 转糖基酶、转肽酶、d-羧肽酶、内肽酶 不同-内酰胺类抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用头孢菌素类抗生素第一代头孢菌素：头孢噻吩、头孢唑啉等 对g+菌有较强作用 第二代头孢菌素：头孢呋辛、头孢克洛等 对产-内酰胺酶的g-杆菌有作用第三代头孢菌素：头孢噻肟、头孢他啶等 对产-内酰胺酶的g-杆菌有较强的作用第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗等 对肠杆菌科细菌和铜绿假单孢菌作用强头孢菌素类抗生素和青霉素结合蛋白结合,抑制细菌细胞壁合成。pbp位于质膜，不同的头孢菌素与不同的pbp结合，发生不同的

17、效应，使菌形成丝状体或球体，最终溶解死亡。其他-内酰胺类抗生素单环-内酰胺类抗生素：氨曲南 对g-杆菌作用强头霉素类：头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑 对g+菌和产esbls有较好作用氧头孢烯类：拉氧头孢-氧头孢烯类衍生物 对产-内酰胺酶的g-杆菌有较强的作用，对产酶的金葡菌也有一定作用碳青霉烯类抗生素：亚胺培南、美洛培南等 对g-杆菌（除嗜麦芽窄食单胞菌外）有很强的活性-内酰胺酶抑制剂- 与-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性克拉维酸 可从链霉菌培养液中分离得到舒巴坦 半合成的酶抑制剂他唑巴坦 半合成的酶抑制剂青霉素+ -内酰胺酶抑制剂氨基糖苷类抗生素链霉素 、卡那霉素 、妥布霉素 、核糖霉

18、素 、巴龙霉素 、新霉素 庆大霉素 、福提霉素阿米卡星、奈替米星、 地贝卡星革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性 ；革兰阴性球菌效果差；革兰阳性球菌有一定活性大观霉素、丙大观霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原体敏感氨基糖苷类抗生素和细菌核糖体30s小亚基发生不可逆的结合，抑制mrna的转录和蛋白合成；造成遗传密码子的错读，产生无意义的蛋白质；吸附在菌体表面，造成细胞膜的损伤，导致膜的渗漏，胞内的k+、腺嘌呤等物质外漏。喹诺酮类抗生素第一代喹诺酮类抗生素：奈啶酸等 大肠杆菌有作用第二代喹诺酮类抗生素：环丙沙星、氧氟沙 星、诺氟沙星等 对g+菌和g-菌均有作用第三代喹诺酮类抗生素（超广谱类抗生素）：左氧氟沙星

19、、司帕沙星等 对g+菌（如mrs、prsp、肠球菌）作用强于二代4-8倍作用机制 作用于dna旋转酶,干扰细菌dna的修复和重组大环内酯类抗生素常用的有：红霉素、麦迪霉素等 主要用于g+菌，对苛养菌及厌养菌有作用，对衣原体、支原体、立克次体、螺旋体等有抑制作用新一代大环内酯类抗生素：阿齐霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素等 较红霉素有更强的抗菌活性作用机制 大环内酯类抗生素可逆结合在细菌核糖体50s大亚基的23s单位上,抑制肽酰基转移酶,影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素四环素类抗生素 广谱抗生素 米诺环素 多西环素等 四环素类抗生素主要与细菌30s核糖体亚单位结合，阻滞氨酰基转移rna与信使rna核蛋白体的受位位点的结合，阻滞肽链延伸，抑制蛋白质合成。氯霉素类抗生素 易进入脑组织 氯霉素 甲砜霉素 氯