化学化工精品 无溶剂系统脂肪酶催化菜籽油与甲醇酯交换反应制取生物柴油的研究

1、摘 要非水相中的酶促酯交换反应广泛应用于油脂的改性。该反应通过酯交换替换甘三酯中的酰基基团来改善油脂性质。生物柴油作为一般石化燃料的良好替代品，其发展前景被世界发达国家普遍看好。本论文从降低生产成本和提高生物柴油品质的角度出发，采用无溶剂系统作为反应体系，利用脂肪酶催化菜籽油与甲醇进行酯交换反应制取生物柴油，简单探讨了生物柴油中甘油含量的测定方法和脂肪酶促酯交换制取生物柴油的反应条件。采用萃取的方法从生物柴油中提取甘油，用高碘酸钠氧化法对甘油含量进行测定，证明了该方法对甘油含量测定的准确性。进而又尝试了采用分批加入甲醇的方法来制取生物柴油，发现此法比一次性加入全部甲醇有更高的反应转化率，但是在

2、反应历程的实验中，分批加入甲醇的方法还有待完善。关键词：无溶剂系统；菜籽油；脂肪酶；酯交换反应；生物柴油abstractenzymatic interesterification in non-aqueous phase has been widely used for improving the quality of oil and fats. this reaction provides a useful alternative for replacing the acyl group of glycerides to modify oil and fats. biodiesel is a

3、 good substitute for petrochemical fuel, and developed country realize that it has good development foreground. to reduce the product cost and improve the quality of biodiesel, lipase-catalyzed interesterification of vegetable oil with methyl alcohol for biodiesel production in a solvent free system

4、 was explored in this dissertation. the analytical method of glycerin in biodiesel and the optimization of reaction conditions were investigated systematically.glycerin could be extracted from biodiesel by extraction. and it could be analysised by sodium periodata oxidimetry. the accuracy of it has

5、been proved. trying to join methyl alcohol by several times in biodiesel production, we found it was more effective than joining methyl alcohol by one time. but it need to be improved in the experiment of reaction process.keywords: solvent free system; vegetable oil; lipase; interesterification; bio

6、diesel目 录摘 要abstract第一章 绪 论11.1 生物柴油研究进展11.1.1 生物柴油的化学组成及物理特性11.1.2 生物柴油生产研究状况11.1.3 生物柴油的制备方法21.1.4 生物柴油生产原料41.2 生物催化与有机合成41.3 非水相酶学51.3.1 非水相酶学的兴起51.3.2 非水相酶催化的优点51.3.3 无溶剂系统61.4 脂肪酶的研究与应用61.4.1 脂肪酶的研究概况61.4.2 脂肪酶的催化机制71.4.3 脂肪酶的底物特异性71.4.4 脂肪酶在油脂工业中的应用81.5 菜籽油的研究与应用91.5.1 菜籽油的性质及组成91.5.2 菜籽油的工业用途

7、91.5.3 菜籽油甲酯化101.6 脂肪酶促酯交换反应101.6.1 脂肪酶促酯交换反应的催化机制101.6.2 菜籽油酶促酯交换生产生物柴油111.6.3 反应体系含水量的影响11第二章 材料与方法132.1 实验材料132.1.1 脂肪酶132.1.2 主要试剂及原料132.2 仪器设备132.3 实验方法142.3.1 试剂的配制142.3.2 酸度计的校准142.3.3 游离甘油含量测定152.3.4 总甘油含量测定15第三章 甘油含量标准曲线的绘制173.1 水中游离甘油测定方法研究173.2 菜籽油中游离甘油含量标准曲线的绘制18小 结19第四章 脂肪酶酯交换制取生物柴油的研究2

8、04.1 菜籽油中总甘油含量测定204.2 甲醇的添加对酯交换反应的影响214.3 生物柴油反应历程实验21小 结23结论与展望24参考文献25致 谢30第一章 绪 论1.1 生物柴油研究进展1.1.1 生物柴油的化学组成及物理特性柴油分子是由15个左右的碳链组成的,研究发现植物油分子则一般由1418个碳链组成,与柴油分子中碳数相近。因此生物柴油就是一种用油菜籽油等可再生植物油加工制取的新型燃料。按化学成分分析,生物柴油燃料是一种高脂酸甲烷,它是通过以不饱和油酸c18为主要成分的甘油脂分解而获得的1。与常规柴油相比,生物柴油具有下述无法比拟的性能。(1)具有优良的环保特性。主要表现在由于生物柴

9、油中硫含量低,使得二氧化硫和硫化物的排放低,可减少约30%(有催化剂时为70%);生物柴油中不含对环境会造成污染的芳香族烷烃,因而废气对人体损害低于柴油。检测表明,与普通柴油相比,使用生物柴油可降低90%的空气毒性,降低94%的患癌率;由于生物柴油含氧量高,使其燃烧时排烟少,一氧化碳的排放与柴油相比减少约10%(有催化剂时为95%);生物柴油的生物降解性高。(2)具有较好的低温发动机启动性能。无添加剂冷滤点达-20。(3)具有较好的润滑性能。使喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率低,使用寿命长。(4)具有较好的安全性能。由于闪点高,生物柴油不属于危险品。因此,在运输、储存、使用方面的优点是显而易见

10、的。(5)具有良好的燃料性能。十六烷值高,使其燃烧性好于柴油,燃烧残留物呈微酸性使催化剂和发动机机油的使用寿命加长。(6)具有可再生性能。作为可再生能源,与石油储量不同其通过农业和生物科学家的努力,可供应量不会枯竭。生物柴油的优良性能使得采用生物柴油的发动机废气排放指标不仅满足目前的欧洲号标准,甚至满足随后即将在欧洲颁布实施的更加严格的欧洲号排放标准。而且由于生物柴油燃烧时排放的二氧化碳远低于该植物生长过程中所吸收的二氧化碳,从而改善由于二氧化碳的排放而导致的全球变暖这一有害于人类的重大环境问题。因此生物柴油是一种真正的绿色柴油2。1.1.2 生物柴油生产研究状况德国的生物柴油主要是利用油菜籽

11、提炼而成，是目前生物柴油利用最广泛的国家，其2002年消费生物柴油达110万t，占世界总消费量210万t的一半左右。在德国1.7万家加油站中，有1400个生物柴油加油站。德国政府鼓励使用生物柴油，对生物柴油生产企业全额免除税收，致使其价格低于普通柴油，目前每升生物柴油零售价比普通柴油便宜310欧分3。另外，美国、意大利、日本等国也已经开始正式生产生物柴油 我国研究生物柴油始于上个世纪80年代，由上海内燃机研究所和贵州山地农机所联合承担课题，并对生物柴油的研究、开发做了大量基础试验探索。中国农业工程研究设计院、辽宁省能源研究所、中国科技大学、河南科学陆军化学所等单位也都对生物柴油作了不同程度的研

12、究。近几年，北京化工大学、江苏石油化工学院、中国农业科学院、华东理工大学、辽河化工厂、长春通达轻工技术研究所等科研院所也加入了生物柴油的研究行列。已研制成功利用菜籽油、大豆油、米糠油、工业猪油、牛油及野生植物小桐籽油等为原料的生物柴油生产工艺4。目前已有一些公司用化学法进行生物柴油的开发生产，如：海南正和生物能源公司和四川古杉油脂化学有限公司都在致力于生物柴油的研究生产。1.1.3 生物柴油的制备方法 生物柴油的制备主要可采用5种方法，其中直接混合法和微乳液法属于物理法，高温热裂解法是化学法，酯交换法又可分为化学酯交换和生物酶促酯交换。使用物理法能够降低动植物油的粘度，但积炭及润滑油污染等问题

13、难以解决；而高温热裂解法的主要产品是生物汽油，生物柴油只是其副产品。相比之下，酯交换法5,6是一种更好的制备方法。1.1.3.1 直接混合法制备生物柴油 在生物柴油研究初期，研究人员设想将天然油脂与柴油、溶剂或醇类混合以降低粘度，提高挥发度7。1983年amans等8将脱胶的大豆油与2号柴油分别以1:1和1:2的比例混合，在直接喷射涡轮发动机上进行600h的试验。当两种油品以1:1混合时，会出现润滑油变浑以及凝胶化现象，而1:2的比例不会出现该现象，可以作为农用机械的替代燃料。ziejewski等人9将葵花籽油与柴油以1:3的体积比混合，测得该混合物在40下的粘度为4.8810-6m2/s，而

14、astm(美国材料实验标推)规定的最高粘度应低于4.0010-6m2/s，因此该混合燃料不适合在直喷柴油发动机中长时间使用。而对红花油与柴油的混合物进行的试验则得到了令人满意的结果。但是在长期的使用过程中该混合物仍会导致润滑油变浑。1.1.3.2 微乳液法制备生物柴油 将动植物油与溶剂混合制成微乳状液也是解决动植物油高粘度的办法之一。微乳状液是一种透明的、热力学稳定的胶体分散系，是由两种不互溶的液体与离子或非离子的两性分子混合而形成的直径在1150nm的胶质平衡体系。1982年georing等用乙醇水溶液与大豆油制成微乳状液，这种微乳状液除了十六烷值较低之外，其他性质均与2号柴油相似。ziej

15、ewski等9以53.3%的冬化葵花籽油、13.3%的甲醇以及33.4%的1-丁醇制成乳状液，在200h的实验室耐久性测试中没有严重的恶化现象，但仍出现了积炭和使润滑油粘度增加等问题。neuma等10使用表面活性剂(主要成分为豆油皂质、十二烷基磺酸钠及脂肪酸乙醇胺)、助表面活性剂(成分为乙基、丙基和异戊基醇)、水、炼制柴油和大豆油为原料，开发了可替代柴油的新的微乳状液体系，其中组成为柴油3.160g、大豆油0.790g、水0.050g、异戊醇0.338g、十二烷基碳酸钠0.676g的微乳状液体系的性质与柴油最为接近。1.1.3.3 高温热裂解法制备生物柴油 最早对植物油进行热裂解的目的是为了合

16、成石油。schwab等11对大豆油热裂解的产物进行了分析，发现烷烃和烯烃的含量很高，占总质量的60%。还发现裂解产物的粘度比普通大豆油下降了3倍多，但是该粘度值还是远高于普通柴油的粘度值。在十六烷值和热值等方面，大豆油裂解产物与普通柴油相近。 1993年，pioch等12对植物油经催化裂解生产生物柴油进行了研究。将椰油和棕榈油以sio2/al2o3为催化剂，在450裂解。裂解得到的产物分为气液固三相，其中液相的成分为生物汽油和生物柴油。分析表明，该生物柴油与普通柴油的性质非常相近。1.1.3.4 化学酯交换法制备生物柴油 各种天然的植物油和动物脂肪以及食品工业的废油，都可以作为酯交换生产生物柴

17、油的原料。可用于酯交换的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇6。其中最为常用的是甲醇，这是由于甲醇的价格较低，同时其碳链短、极性强，能够很快地与脂肪酸甘油酯发生反应，且碱性催化剂易溶于甲醇。该反应可用酸、碱或酶作为催化剂。其中碱性催化剂包括naoh、koh、各种碳酸盐以及钠和钾的醇盐，酸性催化剂常用的是硫酸、磷酸或盐酸。甲醇越多产率越高，但也会给分离带来困难。通过酯交换反应可以使天然油脂(甘油三酸酯)的分子量降至原来的1/3，粘度降低8倍，同时也提高了燃料挥发度。生产出来的生物柴油的粘度与柴油接近，十六烷值达到5013。1.1.3.5 生物酶促酯交换制备生物柴油 新的研究表明，脂肪酶是一种很好的

18、催化醇与脂肪酸甘油酯的酯交换反应的催化剂。酶作为一种生物催化剂，具有高的催化效率和经济性，日益受到关注。目前用化学方法生产生物柴油使用的催化剂存在难以分离以及耗能高等问题，都可以通过使用酶催化剂加以解决。例如以多孔高岭石作为载体的固定酶催化剂14，与其他催化剂相比，不但寿命长，无需经常更换，而且活性高，易于分离，是一种性能上和经济上都具有竞争力的新型催化剂。ban等15以橄榄油和油酸为原料进行酶催化反应，产物中的甲酯含量达到90%。生物法存在以下局限性：一是生物催化剂价格昂贵；二是甲醇对生物催化剂有毒害作用；三是反应体系粘度过高；四是甲醇转化率不高。现有实验证明，在反应过程中必须及时除去反应生

19、成的甘油,否则产生的甘油很容易堵塞颗粒状固定化酶的孔径,使固定化酶寿命大大降低。因此很有必要开发新型脂肪酶固定化方法及酯化工艺,以制备高品质、低成本的生物柴油。1.1.4 生物柴油生产原料理论上一切动物、植物油脂都可以作为生产生物柴油的原料，但目前投入生产的大多是植物油脂，例如菜籽油、豆油、棉籽油、米糠油、棕榈油、野生植物油、桉油、花生油或它们油脚料等。我国有丰富的植物油脂，是油菜生产大国，广袤千里山区又大量种植油料植物，饭店产生的煎炸油也不少。有关资料显示，我国每年消耗植物油1200万t，直接产生下脚酸化油250万t，大中城市餐饮业的发展也产生地沟油达500万t。目前，这些垃圾油一般都作为废

20、物处理，还有一些经过地下作坊重新流入餐桌，直接造成污染。上述资源如果加以很好利用，必有很大的市场潜力。目前，海南正和生物能源有限公司开发出可以采用榨油厂的油脚、黄连木等油料树木的果实以及城市餐饮废油为原料的生产工艺，可以年生产生物柴油1万t，产品已达到国外同类产品的技术水平。另据报道，目前福建已经生产生物柴油5000多吨，其原料是食用油加工过程中的下脚料、地沟油、废猪油等垃圾油，可使福州、厦门两城市的地沟油问题得到有效解决4。1.2 生物催化与有机合成生物催化是蓬勃发展的生物技术中一个重要的具有广泛前景的领域。它是用生物催化剂将有机化合物的生产过程与人们对天然高品质的、有利于环境保护的、可再生

21、利用的产品不断增强的需求结合起来，工业化生产与人类生存密切相关的物质，尤其是食品、饮料、医药、化工和保健用品中的重要原料或组分16-18，甚至可以生产出自然界中不存在或化学方法无法合成的生物活性物质19。与化学合成相比，生物催化具有如下优势：第一，在常温、常压下反应，反应条件温和；第二，反应速度快，反应转化率高；第三，催化反应特异性强，副产物少；第四，更重要的是生物催化的产品品质高，可以避免化学催化产生对人类及其生存环境有害的物质。因此，生物催化被看成是化学工业发展的重要方向之一，许多发达国家将其列在发展的重要位置上20。生物催化剂包括生物细胞和生物大分子酶等。使用活的微生物细胞做催化剂的生物

22、催化过程就是发酵过程。它可以利用价格低廉和结构简单的原料，通过活细胞的代谢产生复杂的化合物。工业化发酵生产有机产品已有一百五十多年的历史。发酵过程的本质也是利用酶来进行催化反应。近年来，随着一些重要有机产物的成功的工业化生产，使用从细胞中提取的酶直接催化单一或多底物来生产有机产品已显示了酶催化反应过程巨大的工业化应用潜力。1.3 非水相酶学1.3.1 非水相酶学的兴起酶能在疏水环境中表现出生物活性，这在生物体中早已被人们所知。在非生物体系的疏水有机溶剂中仍表现出生物活性，这无疑是对长期以来认为生物功能大分子（酶、抗体、核酸等）只能在水溶液中才行使其生物功能以及有机溶剂是它们的变性剂这一传统观点

23、巨大的挑战。1984年美国massachusetts institute of technology(mit)的klibanov21在science上首次发表了非水介质中脂肪酶的催化行为及热稳定性的研究，从此该领域得到迅速发展并取得了突破性的进展。这对进一步加深人们对各种生命活动现象的认识提供了又一探索的领域。经过近二十年的发展，酶学领域诞生了一个全新的学科方向非水相酶学22-24，为生物工程技术又增添了一个新的研究方向。非水相酶学在立体异构体的拆分、聚合物的合成、多肽的合成、药物合成及油脂的改性等方面已显示出了巨大的应用前景25-27。一方面，探索在非水介质中酶的催化行为，充分发挥酶生物催化

24、剂特有的选择性强、催化效率高、反应条件温和等优点，有着巨大的应用价值。另一方面，随着研究的深入，也为许多其他生命领域的研究提供了新的研究方法和手段。例如：用非水体系来精确地控制蛋白质分子表面的含水量，研究蛋白质结构与功能的相互关系；研究蛋白质在有机溶剂中x晶体衍射，可以给出有机分子在蛋白质表面的准确结合位置，为蛋白质类药物设计提供详细信息，减少盲目性。1.3.2 非水相酶催化的优点研究证明，酶在几乎无水的有机介质中不仅可以不变性，而且还有较高的催化活性。与水相催化相比，酶在非水介质中的催化作用有以下优点28-31：（1）增加非极性底物的溶解度；（2）可进行在水相中不能进行的反应（如：酯合成、酯

25、交换）。（3）增加底物浓度，提高反应速度。（4）改变热力学平衡，有利于产物的生成。（5）减少因水引起的副反应（如：酸酐的水解，醌的聚合）。（6）增加酶的刚性，促进稳定性。（7）有利于酶与产物的分离及酶的再利用，简化了生产工艺。正因为具有以上的显著优点，酶在非水介质中的催化作用引起了人们广泛的重视。目前已经证明许多酶，特别是脂肪酶、蛋白酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、醇脱氢酶等都能在有机介质中发挥催化作用。1.3.3 无溶剂系统作为酶反应介质的有机溶剂是影响非水相酶催化的一个重要因素。溶剂体系可归纳为以下几类32：（1）水/水溶性有机溶剂均相体系；（2）水/水不溶性有机溶剂双相体系；（3）微水相；（

26、4）超临界流体；（5）逆相胶团；（6）无溶剂系统；（7）气相；（8）离子液。无溶剂系统是一类无其他溶剂，只含底物和酶的反应体系。同溶剂系统相比，此类反应体系底物浓度高，反应快；无需分离反应介质，简化分离纯化工艺；同时，无溶剂系统不需要使用其他有机溶剂，是一种环保型的酶催化技术33。例如，酶催化的糖基化反应由于竞争性水解反应的发生，其转化率通常较低。但当采用无溶剂系统时，可获得高的转化率34。非水相酶催化是酶工程史上一次飞跃性进步，然而有机溶剂作为反应介质仍有许多缺点，如：价格不低，有毒性及易燃性，且溶剂残留及废弃物的处理在环保意识日益增强的今天亦是必须考虑的因素。由于无溶剂系统不需加入任何溶剂

27、，所以能够避免溶剂系统所带来的不良影响。对比溶剂系统，无溶剂系统具有以下优点35：（1）不需加入有机溶剂，降低了生产的成本；（2）处于高底物浓度的条件下，反应速度快；（3）产物的分离纯化比较简单，不存在有机溶剂的残留问题；（4）无有机溶剂废弃物排放，减少了环境污染。从降低生产成本和环境保护的角度出发，无溶剂系统具有比有机溶剂系统更广阔的发展前景，人们对该领域的研究也会越来越深入。1.4 脂肪酶的研究与应用1.4.1 脂肪酶的研究概况脂肪酶是分解油水界面上脂肪的酶36。根据novo nordisk公司的定义，脂肪酶与酯酶的区别在于：脂肪酶是可以水解一类特殊的酯键三酸甘油酯的酶，而酯酶则是可以水解

28、羧酯键的酶。虽然脂肪酶产品市场销售份额只占全球酶制剂产品的百分之四，在工业生产中的作用还无法与淀粉酶和蛋白酶相比较。但近二十年来由于其用途的不断扩大，加上脂肪酶的结构、催化机理及特性的复杂性都远远超过了淀粉酶和蛋白酶，因此其研究的投入费用也在不断增大。尤其是自1988年，novo nordisk公司首次用基因工程菌生产洗涤剂用碱性脂肪酶获得成功以来，脂肪酶酶源的开发进入了一个新的时期。商业应用的脂肪酶通常来自于微生物，除了在水溶液里表现出的水解功能外，大多数在有机溶剂里能表现出较强的催化活性，其主要反应包括酯化反应37-43、酯交换反应、多肽合成44,45和其他的一些有机合成46-48。目前，

29、随着基因工程手段在酶制剂开发和研究方面的广泛应用以及脂肪酶的品种和催化活力的提高，脂肪酶的应用范围也不断扩大，如：洗涤剂、化妆品、医药、农化、造纸和功能性食品的生产和开发。预计在不久的将来，脂肪酶将同蛋白酶和淀粉酶一样得到更为普遍的应用。1.4.2 脂肪酶的催化机制脂肪酶的主要来源是微生物、哺乳动物和植物。不同来源脂肪酶可催化同一反应。脂肪酶作用在体系的亲水-疏水界面层，催化部位含有亲核催化三联体（ser-his-asp）或（ser-his-glu）49。其催化部位位于分子内部，表面被相对疏水的氨基酸残基形成的-螺旋盖状结构覆盖，对三联体催化部位起保护作用50。通过界面活化可提高催化部位附近的

30、疏水性，导致-螺旋再定向，从而暴露出催化部位51；油水界面的存在，还可以使酶形成不完全的水化层，这有利于疏水性底物的脂肪族侧链折叠到酶分子表面，使酶催化易于进行。1.4.3 脂肪酶的底物特异性酶的底物特异性取决于酶分子的结构，特别是酶活性中心的结构。因此，不同来源的脂肪酶，其结构的差异使酶的底物特异性也不同。脂肪酶的底物特异性包括：1.4.3.1 脂肪酸特异性 脂肪酸特异性是指脂肪酸对底物油脂中具有不同的链长、不同饱和度及不同双键位置的脂肪酸表现出的特殊反应性。不同来源的脂肪酶水解甘油三酯的脂肪酸特异性有很大差异，并可以通过蛋白质工程对脂肪酶的脂肪酸特异性加以改造。pleiss等52分析了6个

31、脂肪酶的酰基结合位点。其结合位点以凹陷的口袋形式存在，其形状可分为三种：（1）裂缝式，如rhizomucor和rhizopus脂肪酶；（2）漏斗式，如candida antarctica脂肪酶、哺乳动物胰脂肪酶和角质脂肪酶；（3）地道式，如candida rugosa脂肪酶。并发现通过突变那些连接位点可以改变酶的脂肪酸特异性。在rhizopus delemar和rhizop-us oryzae脂肪酶口袋底部的v205接近易断裂脂肪酸链的c4处，用亲水的thr替换之，可使酶活降低，用try替代与c6接近的f111，可以提高酶对短链甘三酯的相对专一性，l208和f94与c10c12接近，用较大的或

32、更疏水的残基来替换则增加了短链和中等长度链的相对专一性。f213位于疏水裂缝的末端，接近c16，用更大或更疏水的tyr来替换之，则降低了酶对油酸和硬酯酸的相对专一性。1.4.3.2 位置特异性 位置特异性是指酶对底物甘三酯中1（或3）和2-位置酯键的识别和水解的反应性。研究证明，不少微生物脂肪酶具有1，3-位置特异性，即它们只能选择性地催化1，3-位置酯键水解，对2-位置酯键没有作用。但在具有1，3-位置特异性酶催化的反应中，一般存在速度较慢的非酶催化的酰基迁移，使2-位置酰基跃迁到1（或3）-位置。来源于猪胰、黑曲霉和根霉的脂肪酶，及牛奶脂蛋白脂肪酶（纯酶）和人的脂蛋白脂肪酶均具有1，3-位

33、置特异性，对2-位置酯键没有作用；圆弧青霉的脂肪酶和大鼠脂肪组织的脂蛋白脂肪酶能水解2-位置酯键，无1，3-位置特异性。1.4.3.3 立体特异性 立体特异性是指酶对底物甘油三酯中立体对映结构的1，3-位置酯键的识别和选择性水解，在有机相中酶促酯合成和酯交换时，酶对底物的不同立体结构也表现出立体特异性。据文献报道53，猪胰脂肪酶水解甘油三酯无1，3-位置的立体选择性；人奶和牛奶中脂蛋白脂肪酶优先水解1-位酯键。脂肪酶不仅在催化甘油三酯水解反应中具有上述三种底物特异性，在催化酯合成与交换时，同样具有底物特异性。在有机体系中，酶的底物特异性对催化反应有重大的影响。1.4.4 脂肪酶在油脂工业中的应

34、用脂肪酶具有来源广泛和底物特异性多样化的特点，使其在油脂加工和有机合成中有巨大的应用潜力。近年来，脂肪酶产生菌的选育、微生物脂肪酶的分离纯化及固定化技术的发展，为油脂工业全面引入脂肪酶生物技术提供了条件。根据反应体系的不同，脂肪酶可以催化油脂的水解、酯交换、醇解等54。1.4.4.1 酶促油脂水解 由于水和油的不溶性，脂肪酶催化油脂的水解一般都是在双相的水溶液中进行55,56。脂肪酶可水解天然油脂，制备脂肪酸、甘油和甘单酯，且特别适用于具有生理活性而又不稳定的脂肪酸和具有特定结构的甘油单酯的生产。应用酶法催化油脂水解可避免高温高压的化学法水解所引起的不饱和脂肪酸的氧化、变性，且利用酶的位置特异

35、性和脂肪酸特异性，可以选择性地水解甘三酯中特定位置的酯键和特定脂肪酸。1.4.4.2 酶促酯交换 脂肪酶还可应用于催化酯交换反应，通过酯交换反应，可以把廉价的油脂改良成具有高价值的工业和食用特殊油脂。例如：利用脂肪酶可催化菜籽油和甲醇进行酯交换反应，制取生物柴油；还可催化人造奶油与不饱和脂肪酸的酯交换反应，使人造奶油熔点降低，改良了人造奶油质量。通过酶促酯交换反应，还可制备具有重要生理功能，而用化学方法不能合成的高度不饱和脂肪酸（pufa）卵磷脂，或提高鱼油中n-3pufa的含量，制备功能性食品。1.4.4.3 油脂甘油醇解 脂肪酶可以催化油脂甘油醇解生产甘油单甘酯和双甘酯，且甘油三酯转化率比

36、化学方法的高，无氧化副产物，产物分离简单。在石化能源日益枯竭的今天，应用脂肪酶促油脂甘油醇解技术，把天然动植物油脂转换为生物柴油成了目前的研究热点57。1.4.4.4 生物精炼 生物精炼是借助微生物脂肪酶在一定条件下能催化脂肪酸与甘油之间的酯化反应，从而把油中的大量游离脂肪酸转变成中性甘油酯。这样既降低了酸值，又增加了中性甘油酯的量。并且，从降低炼油损耗和提高油品质量出发来考虑，把生物精炼与常规的碱炼、脱色、脱臭工艺相结合起来，是处理高酸值油的一种潜在技术。1.5 菜籽油的研究与应用1.5.1 菜籽油的性质及组成普通菜籽油是深黄色的，含有菜籽气味和涩味。比重约在0.80.9。精制的菜油则是金黄

37、色的。菜籽油中，含有两大类脂肪酸。一类是饱和脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸等。另一类为不饱和脂肪酸如油酸、芥酸、亚油酸等。脂肪酸分子结构的共同特点是含有有机官能团羧基(-cooh)。菜籽油的主要成份如下表。表1-1 菜籽油主要成分种子来源江苏辽宁陕西四川湖北云南棕榈酸1.82.33.73.53.73.3硬脂酸0.41.41.0微量1.01.3油酸10.726.115.620.516.610.6花生油酸8.112.410.510.59.9芥酸45.932.539.447.045.245.4亚油酸16.615.015.511.414.218.6亚麻酸12.210.19.57.39.420.71.5.2

38、菜籽油的工业用途在我国，菜籽油主要用于食用，其次也用于工业生产。最近四十多年，石油化工发展迅速，大量的石油产品代替了天然油脂。但在能源危机的今天，希望从再生资源天然油脂中，提供更多的长碳链的中间体，具有重大政治和经济意义。第二次世界大战以前，我国的大豆产量占世界首位，后被美国和巴西赶上，但最近几年我国油料增产很快，菜籽的产量增加尤为突出，作为一种再生资源，是我国必不可少的主要食物，又是不可缺少的工业原料。动植物油脂用做机械润滑油有特殊的优点，这是因为动植物油的油膜在金属表面上的粘附能力比无极性矿物油强得多。这对保护金属表面尤为有利，在精密仪器、机械和钟表中，一般用动植物油做润滑油。氧化菜籽油或

39、聚合的菜籽油常用来加到石油中作润滑油用。另外也可用作连续铸钢润滑油、金属热处理滤火剂。菜籽油皂化可以制得各种表面活性剂，也可用于制造肥皂。在制皂的同时，还可得到副产物甘油。菜油磺化可制备皮革柔亮剂。还可作纺织工业中的柔软剂以及作化妆品及发泡剂的原料，用菜油制取硫酸化油，硫酸化的油脂可作切削油的乳化剂、杀虫剂油性喷剂、工业松油清洁剂和消毒剂。对油脂进行热裂反应，可制造发动机燃料，在实验室中已有成功的事例，但由于成本较高，难以大量应用，但这是一项有意义的开发工作。在石油的开采越来越少的今天，用油脂制造发动机燃料以替代石油，应受到重视。总之，菜油在机械工业、橡胶、化工、油漆、纺织等领域，都有广泛的应

40、用，另外菜籽的根茎、叶及油饼都是很好的有机肥料58。1.5.3 菜籽油甲酯化我国传统品种菜籽油中的二十二碳-烯酸（c22:1，芥酸）含量高达4250%59，它是很好的加油材料。菜籽油甲酯化后的产物是脂肪酸甲酯、甘油二酸酯（dg）和甘油-酸酯（mg）。进一步处理这些产物可制得性能优良的加脂剂59,60。b.freedman等人系统地研究了植物油的甲酯化反应61,62，供实验用的植物油有：棉籽油、花生油、大豆油和向日葵油。四种植物油和甲醇反应的适宜条件是：油脂/甲醇(摩尔比)1/41/6，用0.5%naoch3催化、反应温度60，l小时后甲酯的转化率为9398%b.freedman等人还研究了大豆

41、油甲酯化反应动力学63。当大豆油/甲醇(摩尔比)为1/6，0.5%naoch3作催化剂，实验了五个温度点：20、30、40、50和60。根据分析结果，提出了反应的动力学模型可用连续反应来描述，它包括四级对峙反应和二级对峙反应（只计算了反应的表观活化能，没有给出速度常数），他们研究使用的分析检测手段是薄层色谱（tlc）和毛细管色谱（cgc），两者均用氢火焰离子化检测器（fid）。1.6 脂肪酶促酯交换反应1.6.1 脂肪酶促酯交换反应的催化机制非水相中脂肪酶催化酯交换反应的动力学比较复杂。在酯交换反应的过程中，存在着酰基-酶复合物，并把整个反应分为两个步骤。（1）酰基-酶复合物的形成；（2）酰基

42、-酶复合物的溶剂解，包括水解和醇解等方式。脂肪酸和脂肪酸酯均可形成酰基-酶复合物，甘三酯-酶复合物水解生成游离脂肪酸和双甘酯，水和水解生成的双甘酯同时又是酰基-酶复合物溶剂解的竞争性酰基受体。体系中水含量的多少是酯交换反应的重要影响因素，它不仅影响有机相中酶的活性，同时又参与酯交换反应。水含量过高，则以水解反应为主反应；水含量低，则甘油三酯水解程度小，作为酯合成反应的双甘酯浓度低，两种情况都将不能进行有效的酯合成（即酰基-酶复合物的醇解）反应。因此，在酶促酯交换反应中，水含量是一个非常关键的控制参数64。1.6.2 菜籽油酶促酯交换生产生物柴油将一种酯与另一种脂肪酸或酯混合并伴随酰基交换生成新

43、酯的反应叫酯交换反应。菜籽油中进行酯交换反应的成分主要是甘油三酯，选用对甘油三酯有特异性催化作用的脂肪酶来进行酯交换反应，即可制得生物柴油。由于是与甲醇进行反应，甲醇的沸点是44，如果温度过高会加快甲醇的挥发。因此反应温度应控制在30。邓利等65进行了有机溶剂体系中脂肪酶酯交换制取生物柴油的研究，他们用石油醚做溶剂，并研究了甲醇的用量和甲醇的加入方式对脂肪酶催化过程的影响。要实现大规模的工业应用，关键在于解决酶的成本问题，因为酶的价格较高，这就要求所使用的酶催化活性高、稳定性好、使用寿命长。1.6.3 反应体系含水量的影响（1）水的作用 酶在绝对无水的条件下是不可能有催化活性的，水分子直接或间

44、接地通过氢键、疏水键、静电作用、范得华力等来维持酶分子的催化活性结构66。在绝对无水条件下，酶分子的带电基团和极性基团之间相互作用而形成“锁定”的失活构象。加入适量水可削弱这种相互作用，使酶分子的柔性增大，并通过非共价作用力来维持酶的催化活性构象67。氢键、疏水键、静电作用、范得华力等分子内和分子间相互作用力的组合，构成了复杂的网络，在酶分子表面形成一个水化层。酶催化反应就是在环绕着酶分子表面的水层内或界面上进行的。当酶周围含有足够的水分子来维持其天然构象时，这些“必需水”以外的介质对反应影响较小。也就是说，只要酶吸附足够的“必需水”，在有机相中也应显示其催化活力68。所谓的无水体系并不是绝对

45、无水的，而是一种含有微量水的有机溶剂体系（水含量醇解酯交换酯化。所以对于酯交换反应，水含量的多少影响到其副反应（即酯的水解）的进行。水含量偏高，有利于副反应，生成脂肪酸和醇，使酯交换反应的得率偏低。水含量偏低，有利于酯交换和酯化反应。因此在反应介质中可通过控制水的含量，使所期望的反应占主导地位。从酶的稳定性来说，在一般的酶催化反应中，水发挥着双重作用。一方面作为润滑剂赋予蛋白质柔韧性，维持酶活力构象；另一方面，水参与酶的热失活过程，是导致酶热失活的重要因素。有水存在时，随着温度的升高，酶分子会发生以下变化：1.形成不规则结构；2.二硫键受到破坏；3.天冬酰胺和谷胺酰胺脱酰胺基。在有机溶剂体系中

46、因为存在的水量很少，酶表现出极高的热稳定性。因而，在有机相酶催化反应中控制适宜的水含量，可提高酶的稳定性和催化效率，使反应具有一般水溶液体系所不具备的优越性。第二章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 脂肪酶novozym 435，广州明远工贸有限公司2.1.2 主要试剂及原料菜籽油：鲤鱼牌100%纯菜油，四川嘉里粮油工业有限公司高碘酸钠：60g/l酸性溶液，分析纯，浙江温州助剂厂乙二醇：1体积乙二醇用1体积水稀释，分析纯，重庆东方试剂厂甲酸钠：约1mol/l溶液，分析纯，naoh：约0.02mol/l标准溶液，分析纯，成都科龙化工试剂厂盐酸：化学纯，四川省德阳市化学试剂厂甲醇：分析纯，重庆

47、东方试剂厂石油醚：分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司甘油：分析纯，北京化工厂硫酸：分析纯，四川省德阳市化学试剂厂磷酸：分析纯，成都化学试剂厂碘化钾：15%，分析纯，郑州化学试剂二厂邻苯二甲酸氢钾：分析纯，成都化学试剂厂硫代硫酸钠：约0.5mol/l，分析纯，成都化学试剂厂淀粉指示剂：将5g可溶性淀粉（分析纯），用冷去离子水先制成均匀的糊状，加入500ml煮沸的去离子水，迅速搅拌，然后冷却。ph=4.00及ph=9.18的缓冲溶液2.2 仪器设备振荡培养箱：深圳市沙头角国华仪器厂振荡器：hzq-r型，哈尔滨东联电子技术开发有限公司ph计：phs-3c型酸度计，成都方舟科技开发公司。光学读数

48、分析天平：型号tg328a，湘仪天平仪器厂上皿电子天平：型号fa1104，上海精科天平电热鼓风干燥箱：型号101-1，上海三星电热仪器厂2.3 实验方法2.3.1 试剂的配制高碘酸钠酸性溶液：（1）在含有60ml0.1n硫酸的去离子水中，溶解高碘酸钠30g，并稀释至总的容积为500ml。在溶解高碘酸钠时不可加热，将溶液存放在磨口塞棕色玻璃瓶内，并保存在暗处。（2）质量的鉴定，吸取高碘酸钠溶液10ml，放在250ml的容量瓶中，稀释至刻度，并充分混合。在50ml去离子水中含有0.50.6g甘油的溶液内，用吸管加入稀释后的高碘酸钠溶液50ml，另外，只用50ml的去离子水做空白实验，静置30min

49、，加盐酸5ml及15%的碘化钾溶液10ml，摇动混合后静置5min，再加去离子水100ml，在不断摇动下，用0.5mol/l硫代硫酸钠溶液滴定至黄色接近完全消失时加12ml淀粉液指示剂，继续加硫代硫酸钠溶液进行缓缓滴定，直至蓝色恰好消失为止，当甘油溶液的滴定数用空白实验的滴定数来除后，其答数在0.7500.765之间时，说明高碘酸钠溶液的质量是令人满意的70。本次实验鉴定的答数为0.758。naoh标准溶液的标定：称取0.6g于105110烘至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，称准至0.0001g，溶于50ml去离子水中，加2滴酚酞指示液，用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时做空白实验。则氢

50、氧化钠标准溶液浓度按下式计算：(naoh)=式中：m邻苯二甲酸氢钾之质量，g；v1氢氧化钠溶液之用量，ml；v2空白实验氢氧化钠溶液之用量，ml；0.2042与1.00ml氢氧化钠标准溶液c(naoh)=1.000mol/l相当的以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量71。2.3.2 酸度计的校准（1）“斜率”调节器顺时针旋到底，调节“温度”调节器使所指的温度与溶液温度相同，并摇动试杯使溶液均匀。（2）把电极插入已知ph=6.86的缓冲溶液，调节“定位”调节器，使一起的指示值为该缓冲溶液所在温度相应的ph值（ph=6.86）。（3）用去离子水清洗电极，并用滤纸吸干，把电极插入另一已知ph缓冲溶液（ph

51、=9.18）并摇动试杯使溶液均匀。（4）调节“斜率”调节器，使仪器的指示值为溶液所在温度相应的ph值（ph=9.18）。重复（2）（4）步骤，直至达到要求为止。仪器两点标定已告完成，经标定的仪器的定位电位器与斜率调节器不应再有变动。2.3.3 游离甘油含量测定参考gb/t 13216.691甘油试验方法 甘油含量的测定。在强酸介质中，甘油被高碘酸钠冷氧化，反应产生的甲酸以ph计指示，用氢氧化钠标准溶液滴定。反应式为：ch2ohchohch2oh+2naio4hcooh+2hcho+2naio3+h2o具体步骤是，用30ml石油醚溶解油样（所含甘油重应低于0.05g），再用25ml水萃取，重复4

52、次，收集所有水相，煮沸以除去水相中残留的有机溶剂。冷却后在ph计的指示下，用氢氧化钠溶液调节ph值为7.9。准确加入5ml高碘酸钠溶液，缓和搅匀，盖上盖子，在温度不超过35暗处放置30min，然后加5ml乙二醇混合，在同样条件下放置20min。准确加5ml甲酸钠溶液，用ph计指示，以naoh标准溶液滴定存在的酸度至7.9。取30ml石油醚溶液，用水萃取4次，每次25ml，来做空白实验。但加入高碘酸钠溶液之前，空白溶液应调节至ph为6.5，加入高碘酸钠溶液之后，滴定终点至ph为6.5。甘油含量，用质量百分数表示，按下式计算：式中：v1测定样品所耗用naoh标准溶液体积，ml；v2空白实验所耗用naoh标准溶液体积，ml；m检测样品质量，g；c所用naoh标准溶液浓度，mol/l；0.0921甘油毫摩尔质量，g/mmol2.3.4 总甘油含量测定将以甘油酯形式存在的甘油通过醇解、酸化等化学方法转变为游离甘油，然后用测游离甘油方法进行测定。甘油酯的醇解是很容易的，通常是以油脂与过量的醇在碱或酸催化剂的存在下进行。用碱作催化剂时可以使反应更容易在较低的温度下进行，并可获得较高的收获率。在转化过程中，由于样品油中含有游离脂肪酸，与碱生成肥皂，使反应混合物呈胶状，甘油也混在肥皂中不能分离。于是加入磷