三氧化二砷诱导Hep2细胞凋亡及其对细胞周期各时相的影响

1、文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持. 三氧化二碑诱导Hep-2细胞凋亡及其对细胞 周期各时相的影响 【摘要】探讨三氧化二碑（As203）诱导Hep-2细胞凋亡机制及 其对细胞周期各时相的影响。方法 应用唾哇蓝（MTT）比色法和流式 细胞术法检测不同浓度的As203对Hep-2细胞的增殖抑制率，细胞周 期改变及凋亡率，并通过电子显微镜观察其亚细胞结构改变。结果 As203对Hep-2细胞增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，流式 细胞术结果显示，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增 多，电子显微镜结果显示，细胞空化，线粒体肿胀，染色质趋边凝集。

2、 结论As203对Hep-2细胞有明显的增殖抑制作用，阻止G1期细胞向S 期转化进程，诱导Hep-2细胞凋亡。 【关键词】As203细胞周期凋亡Hep-2细胞 近年研究结果证实，肿瘤的发生不仅与细胞增殖周期有关，且与 凋亡亦有特殊的生物学意义1。因此，探讨细胞凋亡机制及发现新 的凋亡诱导剂具有理论和实际意义，As203是中药砒霜的主要有效成 分，作为药用已有2 400多年的历史，20世纪70年代发现可有效治 疗急性早幼粒细胞白血病，进一步的实验研究发现As203对其他恶性 肿瘤也有作用2。木研究以Hep-2细胞为靶系统，体外探讨As203 对细胞周期变化及其诱导凋亡作用，以期为抗喉癌药物的筛选

3、提供依 据。 1材料与方法 1.1材料（l）As203为哈尔滨医科大学附属第一医院制备，以 磷酸盐缓冲液配制成50 Umol/L储存液,-20 C冰箱内保存备用。（2） Hep-2细胞（人喉癌细胞株）由吉林省肿瘤研究所提供。（3） RPMI 1640 培养基，MTT试剂为美国Sigma公司产品。 1.2方法 1. 2. 1 MTT比色法 取对数生长期的Hep-2细胞，经0. 25%胰蛋白 酶消化，收集细胞，细胞数为2X106/ml,接种于96孔塑料培养板内 每孔100 U1,当细胞生长达到80%汇合时，每孔内分别加入不同浓度 的 As203 溶液，0 Umol/L、1 Umol/L、3 Umo

4、l/L 5 Hmol/L,每 个浓度6复孔，静止培养24 h,于结束前6 h加入MTT试剂20 u 1/ 孔，终浓度为500 mg/L,继续培养6 h加入酸化异丙醇50 U1/孔， 振荡5 min,使MTT还原产物完全溶解，用酶标仪于550 nm波长处测 定各孔吸光度A值，按下列公式计算Hep-2细胞增殖抑制率。Hep-2 细胞抑制率=（1-加药孔细胞A值一对照孔细胞A值）X100%,结果见 表1。 1.2.2流式细胞术 细胞培养及分组同MTT比色法，不同之处为 将96孔培养板改为50 ml培养瓶进行，培养结束后用0. 25%胰蛋白酶 消化收集细胞，PBS洗二次，70%冷乙醇固定，上机前过4S

5、目网，调 细胞数为lX106/ml,上机分析细胞周期的改变及细胞凋亡率，结果 见表2。 1.2.3透射电镜观察Hep-2细胞超微结构，细胞分组及培养条 件同MTT比色法，收集经不同浓度As203作用的Hep-2细胞，离心弃 上清，将沉淀于管底的Hep-2细胞用2. 5%戊二醛前固定，1%饿酸后固 定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电镜观察, 拍照，结果见图1, 2。 1.2.4统计学方法 随机分组，组间比较用F检验，数据以均数 土标准差(xs)表示。表1不同浓度As203对Hep-2细胞增殖抑制 率2结果 表1结果表明，不同浓度As203对Hep-2细胞增殖均有抑制作用， 组

6、间比较差异显著，Hep-2细胞增殖抑制率与As203浓度呈正相关 (r二0.842)。表2 As203对Hep-2细胞周期各时相影响及凋亡率 表2 结果表明，不同浓度的As203对Hep-2细胞周期均有影响，与对照组 相比较差异均显著，随着药物浓度的上升，其抑制率亦上升，但是3 U mol/L与5 Umol/L相比，差异无统计学意义，但有上升趋势。 图13 U mol/L As203对Hep-2亚细胞结构改变，细胞空化，线 粒体肿胀(X5000) 图2 5 U mol/L As203对Hep-2亚细胞结构改变，细胞核破碎, 可见凋亡小体(X5000) 3讨论 近年来，有关细胞周期调控机制及其与

7、恶性肿瘤发生的关系研究 进展较快，研究结果表明，化学结构不同，作用靶点各异的抗肿瘤药 物，既可以阻滞细胞周期的进程，又可以诱导相应的细胞发生凋亡， 而且能否诱导细胞凋亡己成为评价抗肿瘤药物疗效的重要标志3。 本研究应用MTT比色法检测As203对Hep-2细胞的增殖抑制率, 收到了满意的效果，结果显示，As203对Hep-2细胞抑制率呈剂量依 赖性，抑制率为29%52%,因为MTT试剂可被哺乳动物细胞线粒体中 的脱氢酶还原成蓝色甲朕颗粒，且甲朕生成的量与活细胞数量及细胞 活化状态呈线性关系，该法是一种检测细胞存活的客观指标，广泛应 用于抗肿瘤药物的筛选和细胞毒性实验。 流式细胞仪结果显示，不同

8、浓度的As203对Hep-2细胞周期均有 影响，与对照组相比差异均显著，但在组间比较时，3 U mol/L与5 U mol/L差异不显著，但是在量上还是有区别的。As203可使Hep-2细胞 G0/G1细胞阻滞，G0/G1期细胞增多，影响G1期细胞向S期细胞转化 进程，致使S期细胞减少，而G2/M期细胞相对增多，在真核细胞周期 演进过程中存在一关键过渡点4,当其受到外界压力时会限制细胞 周期转变，被称为细胞周期检测点，主要有G0/G1期检测点，S期检 测点和G2/M期检测点，我们的结果显示，As203对Hep-2细胞G1期 阻滞，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M相对增多，而G2/M期细

9、胞增多是细胞损伤的普通反应，这一点从细胞凋亡率上反映更为明显, 与文献报道相一致5,药物作用后，细胞首先通过S期缓慢，继之 阻滞于G2/M期，高浓度时细胞死亡，而死亡的形式是以凋亡为主。因 此，本研究证明As203为细胞周期特异性药物，主要作用G1期。 此外，本研究还应用电子显微镜观察As203作用的Hep-2细胞超 微结构改变，细胞高度空化，线粒体肿胀，染色质趋边凝集，可见到 凋亡小体改变。 本实验通过多种方法证明As203对Hep-2细胞系有较强的诱导凋 亡作用，具有剂量依赖性，为As203临床应用提供理论依据。 【参考文献】 1陈立鹤，关伟康.细胞死亡方式研究进展.国际病理科学与临床 杂

10、志,2005, 25 (6)： 507-509. 2郝杰，刘云鹏.三氧化二碑抗肿瘤临床应用进展.国外医学肿 瘤学分册，2004, 31 (2)： 132-134. 3 Bai YQ, Miyake S, Iwai T, et al. C0X2, a homelbox transcription factor, upregulates transcription of the P21/WAF1/CIPI gene. Oncogene, 2003,22 (39) :7942-7947. 4 Bartek J, Lukas J. Mammalian G1 and S-phase checkpoint