谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定

1、谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定一、实验目的掌握茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理和方法 ，测定谷物种子蛋白质中赖氨酸 含量。二、实验原理蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的&NH2，它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物质，其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系。因此，用已知浓度的游离氨基酸制作标准曲线，通过比色分析（530nm ）即可测定出样品中的赖 氨酸含量。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有 一个游离氨基（&NH 2），所以通常 用亮氨酸配制标准液。但由于这两种氨基酸分子质量不同， 以亮氨酸为标准计算 赖氨酸含量时，应乘以校正系数1.1515，最后再减去样品中游离氨基酸含量。三、实验仪

2、器1 电子分析天平（1/1000 ）、可见分光光度计、恒温水浴箱、干燥器、移液 器。2 试管架（塑及铝）、具塞试管、具塞三角瓶、细口瓶、漏斗（或 0.45um 滤 膜）、吸管等。四、实验试剂1 . 0.4mol/L 柠檬酸缓冲液：称取4.202g柠檬酸和5.88g柠檬酸三钠，溶于 100ml蒸馏水中。2 .茚三酮试剂：称40mg二氯化锡（防腐）溶于25ml柠檬酸缓冲液中；称lg 茚三酮溶于25ml 95 %乙醇中；将上述两液混合摇匀，滤去沉淀，上清液置冰箱中保存备用。3 . 0.02mol/L 盐酸：取12mol/L 盐酸0.17ml，用蒸馏水稀释定容至100ml。4 .亮氨酸标准液：准确称取

3、20mg亮氨酸，加数滴0.02mol/L 盐酸使之溶解， 然后用蒸馏水稀释定容到100ml，则得浓度为200g /ml的标准液。5 . 60 %乙醇。6 . 4 %碳酸钠：称取4g无水碳酸钠，溶于100 ml蒸馏水。7 . 2 %碳酸钠。五、操作步骤1 标准曲线的制作。取7支具塞试管，按表进行编号、加入试剂，顺序操作。以第1管为空白，在530nm波长下比色，读取吸光度值。并以吸光度值为纵坐标，亮氨酸含量（yg 为横坐标，绘制标准曲线。2 样品前处理不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过80100目筛子，收集过筛后的细粉， 放入广口瓶中，加入沸程6090 C的石油醚，使其淹过粉面，浸泡 8小时,

4、不时摇动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂 玉米粉凉在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置于干燥器内， 保存备用。3 .样品的测定取15mg已粉碎脱脂的玉米样品于具塞干燥试管内，加2%碳酸钠1.0ml，于80 C水浴中提取20min，然后加茚三酮试剂2.0mI ,继续保温显色30min ， 冷却后加60 %乙醇3.0ml，混匀后过滤或离心，然后在530nm 波长下比色。六、实验结果样品中赖氨酸的含量（% ）=从标准曲线上查得值（yg） X10-3/（样品重mg） X 1.1515 X100%-C校正系数：1.1515 ; C:游离的氨基酸含量七、注意事

5、项1 各种作物种子中游离氨基酸含量是：玉米0.01 %、小麦0.05 %、水稻0.01 %、 高粮0.04 %。2 茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复， 必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色。标准曲线的制作及样品测定参考表试管号试剂1#（空白）2#3#4#5#6#7#（样品）亮氨酸标准液（ml）00.10.20.30.40.5/蒸馏水（ml）0.50.40.30.20.10/亮氨酸含量（y g）020406080100/4%碳酸钠（ml）0.50.50.50.50.50.5/脱脂样品（mg）/152%碳酸钠（ml）/1.0/80C水浴2

6、0分钟茚三酮试剂（ml）2.02.02.02.02.02.02.0混匀，加塞，80C水浴30分钟，冷却至室温60%乙醇（ml）3.03.03.03.03.03.03.0/过滤混匀A530蛋白质中赖氨酸（lysine , Lys ）的含量是谷物品质的主要指标之一。 由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖 氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶 液显色法和染料结合法（Dye Binding Lysine，DBL ）测玉米种子中赖氨酸含量。一、茚三酮显色法原理：谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的-NH 2 ,它与茚三酮（ninhydrin ）试剂可发生颜色反应，

7、生成紫红色物质， 其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同 的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖 氨酸的含量.二、材料、仪器设备（一）材料：不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程 6090 C的石油醚， 使其淹过粉面，浸泡8h，不时搅动进行脱脂。然后过滤，并用石油 醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上， 置 阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内，保存备用。（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2.水浴锅；3试管；4.圆 头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套）。（三）试剂：

8、1.缓冲溶液，称取30g甲酸钠，溶解于约60ml蒸馏水中，加入10ml8 %的甲酸，最后加水到100ml ; 2.茚三酮试剂， 称取1g茚三酮和1g氯化镉（CdCHzO）,加入25ml上述缓冲溶液和75ml乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。若出现沉淀，则 过滤后使用。该溶液一定要头一天配制，第二天使用，不宜清代 红顶商人”胡雪岩说： 做生意顶要紧的是眼光，看得到一省，就能做一省的生意；看得到天下，就能做天下的生意；看得到外国，就能做外国的生意。”可见，一个人的心胸和眼光，决定了他志向的短浅或高远；一个人的希望和梦想，决定了他的人生暗淡或辉煌。人生能有几回搏，有生不搏待何时！所有的机遇和成功，都在充满阳光，充满希望的大道之上！我们走过了黑夜，就迎来了黎明；走过了荆棘，就迎来了花丛；走过了坎坷，就走出了泥泞；走过了失败，就走向了成功！一个人只要心存希望，坚强坚韧，坚持不懈，勇往直前地去追寻，去探索，去拼搏，他总有一天会成功。正如郑板桥所具有的人格和精神：咬定青山不放松，立根原在破岩中。千磨万击还坚劲，任尔东南西北风。”梦想在