唐山师范学院综合性-设计性试验项目申报表

1、2007 年 月 日唐山师范学院 综合性、设计性实验项目申报表申报单位名称： 生命科学系实验项 目名称唾液淀粉酶活性分析实验项目性质综合性设计性所属课程生物化学实验 开设学期第 3 学期综合 /设计性实验学时数 5实验室 名称生物化学及植物生理 学实验室地点5401每组人数 4项目负 责人李春香联系 电话经费预算（元）500详细说明该 实验涉及哪 些知识点1、 唾液淀粉酶的制备2、 环境条件对唾液淀粉酶活性的影响3、 唾液淀粉酶的专一性4、 唾液淀粉酶活性的测定参加实验指 导人员李春香、张淑红、高凤菊实验项目建 设进度安排2007 年 6 月：申报实验项目2007年 6月2007年 9月：准备

2、试验材料及仪器，完善各项准备工作2007 年 10 月：首次开设试验项目，进行效果分析主要仪 器设备分光光度计 恒温水浴锅 电炉实验内容及 拟达到的培 养目标实验内容：学生自制唾液淀粉酶，分析影响唾液淀粉酶活性的环境条件，并在得出的最适 条件下测定唾液淀粉酶的活性。培养目标：通过实验内容的学习，使学生从整体掌握酶学的基本知识以及测定酶活性的基 本思路和方法；通过实验结果的分析，培养学生独立分析问题的能力。系论证 意见系主任签名： （盖章） 年月日主管部门 意见（盖章）年月日综合性、设计性实验项目指导书 生物化学实验 实验项目：唾液淀粉酶活性分析张淑红 编 写适用专业： 生物科学 生物技术唐山师

3、范学院生命科学系2007年 5 月实验学时： 5 学时实验类型：综合性每组人数： 5 人组一、实验目的1、通过本实验的学习， 使学生掌握酶学的基本知识，特别是唾液淀粉酶酶活性的测定 方法。2、通过实验结果的分析，培养学生独立分析问题的能力，为今后的学习和科研工作奠 定基础。二、实验原理1、影响酶促反应的因素淀粉受唾液淀粉酶的作用水解成麦芽糖和少量葡萄糖。 通常以测定淀粉水解的程度 （底 物减少）或麦芽糖生成的数量（产物增加）来衡量淀粉酶的活性。淀粉经淀粉酶水解后得 到分子大小不相同的糊精， 糊精遇碘生成不同的颜色。 随着糊精分子量的降低依次为蓝色、 紫色、暗褐色或红色、无色。酶的活性受温度的双

4、重影响。低温时酶活性表现较低，在一定范围内，酶活性随温度 上升而增高。通常每升高 10，反应速度增加一倍左右；另一方面，温度越高使酶蛋白变 性越快，致使酶活性随温度上升而降低，以致完全丧失活性。当酶促反应速度达到最大值 时的温度，称为酶作用的最适温度。 本实验以唾液淀粉酶对淀粉的水解作用为例， 观察 0、 37和 100 三种温度对酶活性的影响。实验中各管除温度外，其它反应条件皆相同。唾 液淀粉酶可催化淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精及麦芽糖。它们遇碘呈现不同的颜色 反应，故可利用碘反应的颜色对比来判定不同温度下酶活性的大小。酶的活性受环境 pH 的影响极为显著。 因 pH 影响酶蛋白和底物的

5、解离状态， 从而明显 改变酶与底物的结合和催化作用。 每一种酶在一定的条件下都有它发挥作用的最适 pH，此 时酶的活性最大。当其它条件相同时，离最适 pH 越近，其活性越大，即所催化的反应速 度越快。本实验利用唾液淀粉酶对淀粉的水解作用，在其它条件相同时，对比观察 pH 变 化对酶活性的影响，用碘反应判断结果。另外激活剂和抑制剂对酶活也具有一定的影响， 能增高酶活性的物质称为酶的激活剂， 能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。2、酶作用的专一性麦芽糖和葡萄糖都具有还原性，能使班氏试剂中的二价铜离子（Cu2+）还原成一价铜离子（Cu+）生成砖红色的氧化亚铜沉淀。而蔗糖不能被水解也不具有还

6、原性，故不能被班 氏试剂还原。利用此性质可以检测唾液淀粉酶的专一性。3、酶活性的测定酶活力也称酶活性，是以在最适温度、 最适 pH 等条件下，催化一定的化学反应的初速 度来表示。本实验是以一定量的唾液淀粉酶液在实验得出的最佳条件下，在一定的初始时 间里将淀粉还原为还原糖，然后通过与 DNS 试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量， 从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，在最佳实验条件下每分钟水解淀粉 生成 1mg 还原糖作为一个淀粉酶活力单位，记为 1U。在 NaOH 和丙三醇存在下， 3,5二硝基水杨酸（ DNS ）与还原糖共热后被还原生成氨 基化合物。在过量的 NaOH 碱性溶液

7、中此化合物呈桔红色，在 540nm 波长处有最大吸收， 在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含 糖量。三、实验方案（一）唾液淀粉酶的制备1、每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。2、先用蒸馏水漱口，将口腔内的食物残渣清除干净。3、口含约 5mL 蒸馏水，做咀嚼动作 12min，以分泌较多的唾液。然后将口腔中的唾 液吐入一个干净的小烧杯中。稀释至 100mL，备用。（二）温度对酶活性的影响1、准备好 37水浴、冰水浴及沸水浴，白瓷板中加碘液备用。2、取小试管 4支，编号，各加 1%淀粉溶液 30 滴，pH 6.8缓冲液 10 滴。 1号管做对照， 2号管放

8、37水浴， 3号管放冰水浴， 4 号管放沸水浴中，各预温 10min3、向1号管加蒸馏水 10滴，向2、3和4号管各加稀释唾液 10滴，混匀，仍放原水浴中。4、5min 后由 2 号管每隔一定时间（ 1 或 2min），取液一滴于白瓷凹板上做碘反应，观 察并记录颜色变化情况，到碘反应接近浅红色时，取出各管，包括 1 号管，分别各取 1 滴 做碘反应，观察对比结果。5、把4支试管均放入 37水浴中，510min 后取出，向各管内加碘液 2滴，混匀，观察 结果。综合分析所测三种温度下的酶活性情况，并以 1 号管为对照说明冰水浴及沸水浴两温 度对酶活性影响的异同，得出唾液淀粉酶的最适反应温度。（三）

9、pH 对酶活性的影响 1、白瓷板中加碘液备用，准备好 37水浴。2、取小试管 4 支，编号，按下表加入试剂，混匀。管号12341%淀粉（ d）303030300.1mol/L 磷酸盐缓冲液（ d）10101010(pH5.0)(pH6.8)(pH 8)(pH6.8)3、4号管加稀释唾液 10滴, 放 37水浴中，记时，每隔 1由第 4号试管中取出 1滴 溶液做碘反应，待碘反应呈浅红色或橙黄色时，取出试管，记录保温时间。4、13号试管放入 37水浴中，以 1min 间隔，并记录时间，依次向 1至 3号管中加 入稀释唾液 10滴，摇匀，按照 4号管的保温时间，以 1min 间隔，依次取出各管，并立

10、即 加碘液 2滴，混匀。观察各管呈现的颜色，判断在不同 pH 下淀粉被水解的程度，分析 pH 对淀粉酶活性的影响，并确定其最适 pH。（四）取 4 支试管，按下表编号后进行实验。管号12340.1% 淀粉溶液（ d）30303030稀释的新鲜唾液（ d）101010101% NaCl 溶液（ d）101% CuSO4 溶液( d)101% Na2SO4 溶液（ d） 蒸馏水（ d）KI I2溶液（ d） 现象37恒温水浴中保温 10min102310232323酶的专一性取试管 3 支，编号，按下表操作：管号1231%淀粉 （ d）10101% 蔗糖 （d）10pH6.8 缓冲液 （d）101

11、010稀释唾液 （ d）55煮沸的唾液 （ d）5各管混匀后，置37水浴中保温 10min班氏试剂（ d）202020将上述各管放沸水浴中煮沸 35 分钟, 观察结果。六）唾液淀粉酶活性的测定1、标准曲线的制备取 6 支试管，按下表加入 1.0mg/mL 葡萄糖标准液和蒸馏水项目空白12345葡萄糖溶液（ mL ）00.20.30.40.50.6蒸馏水（ mL ）32.82.72.62.52.4葡萄糖的浓度 （mg/mL）01/151/102/151/63/15加热沸水浴加热5 分钟冷却立即用冷水冷却光密度（ OD 540 ）取出后用流动水迅速冷却，在 540nm 波长处测定光吸收值。以葡萄糖

12、含量（ mg/mL ） 为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2、唾液淀粉酶活性的测定1234最适 pH 值缓冲液（ mL ）11111淀粉溶液 0.3%NaCl（ mL）1111唾液淀粉酶（ mL ）1110蒸馏水（ mL ）0001酶促反应摇匀，最适温度下水浴 5minDNS 试剂（ mL ）2222显色反应沸水浴5min取出后用流动水迅速冷却，稀释一定倍数，摇匀，在 540nm 波长处测定光吸收值。测 定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖含量，计算酶的活性。四、主要仪器及试剂（一）试剂1、1%淀粉2、0.1mol/L pH5-8 磷酸盐缓冲液：分别配制下列二液，再按下表

13、混合后加水稀释一倍 即可。（1）0.2mol/L NaH 2PO4液：称取 NaH2PO42H2O 31.2g ，加水准确定溶至 1000mL。（2）0.2mol/L Na2HPO412H2O 71.64g ，加水准确定溶至 1000mL。pH0.2mol/L NaH 2PO4 (mL)0.2mol/L Na 2HPO4 (mL)598.11.96.851.049.085.394.73、碘液：碘化钾 1g 加少许水溶解后，再加碘 0.5g，溶后加水至 100mL，混匀。用时 加水稀释 10 倍。4、0.1% 淀粉溶液5、1% NaCl 溶液6、1% CuSO4溶液7、1% Na2SO4溶液8、

14、1% 蔗糖9、班氏试剂：柠檬酸钠 173g和碳酸钠 100g溶于约 700mL 水中，另将硫酸铜 17.3g 溶于 100mL 水中。可分别加热助溶。冷却后将两液混合，再加水至 1000mL 混匀。10、3,5二硝基水杨酸（ DNS）试剂：称取 6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中， 溶解后移入 1000mL 容量瓶中，加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 325mL，再加入 45g 丙三 醇，摇匀，冷却后定容至 1000mL。11、葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖 100mg，加少量蒸馏水溶解 后，以蒸馏水定容至 100mL，即含葡萄糖为 1.0mg/mL。12、1%淀粉 0.3NaCl（二）仪器水浴锅；电炉；分光光度计五、实验要求要求学生预习生物化学教材中酶学一章的内容，特别是影响酶促反应因素一节。并且 查阅资料了解 DNS 法测定还原糖的原理。六、思考题1、比色时为什么要设计空白管？2、进行酶学实验必须注意控制哪些条件？为什么？七、实验报告实验报告是实验的总结和汇报， 通过实验报告的写作可以分析总结实验的经验和问题， 学会处理各种实验数据的方法，加深对生物化学实验的理解和掌握，同时也是学习撰写科 学研究论文的过程。实验报告的格式应为：1