血红蛋白的提取及分离

1、血红蛋白的提取和分离”的实验分析及教学组织人民教育出版社课程教材研究所吴成军东北师范大学附属中学赵伟涛“血红蛋白的提取和分离”是人教版选修模块生物技术实践中的实验内容，其目的 是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法，该实验虽 然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，因此，学生的学习兴趣很高。下面结合人教 版教材对该实验进行分析并提出相应的教学建议。1. 习得实验原理和方法1. 1初步获取血红蛋白的原理和方法（样品的处理和粗分离）实验步 骤实验目的实验原理操作方法结果判断洗涤 红细胞获取较纯净的红细胞通过离心将密度 不同的物质分离低速离心，去除 上清液，反复加

2、生理盐水并离心直到上清液 未呈现黄色 为止释放 血红蛋 白破裂红细 胞，释放血 红蛋白低渗溶液中红细 胞破裂；甲苯溶解 膜脂，加速细胞破 裂（相似相溶原 理）加蒸馏水，再加 甲苯，磁力搅拌 器充分搅拌无明显现象分离 血红蛋 白溶液初步得到 血红蛋白 溶液通过离心将密度 不同的物质分离离心（较高速）试管溶液分 为4层透析去掉液体 中的小分 子物质小分子物质 容易透出透析袋透析（12小时）透析袋中物 质的颜色更 红1. 2分离纯化蛋白质的原理与方法凝胶色谱法（分子筛效应）凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电

3、吸附和扩散作用容易进入凝胶内部 的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩 散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最 后流出层析柱。而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒 间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。分子量介于二者之间的物质， 虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的 速度比小分子快，而比大分子慢。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。需要注意的是，有部分小分子蛋白质未进入凝胶内部，而在外部移动，因此，如果需要得到纯度

4、更高的蛋白质分子，可将色谱柱中的凝胶溶液进行平衡后进行再次冼脱和分离。1. 3鉴定蛋白质纯度的原理与方法电泳蛋白质分子的基本单位是氨基酸，氨基酸的一些基团在一定的 pH下会发生水解或电离从 而带有电荷。但总的来说蛋白质分子一般带有负电。在电场的作用下，带电的蛋白质分子会 向着电泳槽中的正极方向移动。由于样品中各种蛋白质分子净电荷的量的差异以及蛋白质分 子本身的大小等因素，使蛋白质分子产生不同的迁移速率，从而将样品中各种蛋白质分子分 离开。由于蛋白质分子带电电荷比较复杂，净电荷总量与蛋白质分子的质量不成正比，而蛋白 质分子的质量又是衡定的，电泳时在带电量和分子质量两种因素的作用下会产生迁移速率的

5、 复杂化，不能正确地将分子质量不同的蛋白质分子分离开，因此，实际操作中，一般会将蛋 白质分子与SDS(十二烷基硫酸钠)发生反应形成蛋白质一SDS复合物，由于SDS所带负电荷 的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使蛋白质 的迁移率完全取决于蛋白质分子质量的大小。在电场条件下，分子量大的蛋白质迁移率慢， 离前沿较远，而分子量小的蛋白质迁移快，离前沿较近。这样，不同分子量大小的蛋白质得 到了分离。如果蛋白质的纯度高，迁移率一致，就会形成前沿整齐、清晰的条带。2. 正确定位教学目标以上原理和方法中，“初步获取血红蛋白的原理和方法”比较简单，又有必修的基础， 因此学生

6、容易理解；凝胶色谱法的原理容易理解，但操作复杂，难度较高，是学生学习的重 点；电泳的原理和方法比较复杂，绝大多数学校目前缺乏相应的实验设备，而且是用于鉴定 分离后蛋白质纯度的后续实验，因此可作为选学内容。基于以上分析，特确定如下的教学目 标、教学的重点和难点。2. 1教学目标(1) 说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法。(2) 说明凝胶色谱法的原理和方法。(3 )说出电泳的基本原理和方法。(4)进行样品的预处理。(5 )运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。2. 2教学重点和难点教学重点：凝胶色谱法的原理和方法。教学难点：样品的预处理；色谱柱的装填；纯化分离操作。3. 实验前准备3. 1几

7、种重要实验试剂的配制及注意事项3. 1. 1磷酸缓冲液（20mmol/L）的配制及注意事项配制步骤配制的溶液配制方法注意事项0 .2 mol/L 的NaHP(4溶液将71 . 64 g 的 NaaHPQ 12H20充分溶解于1000 mL的蒸馏水中在混合两种 溶液时，注 意用酸度计 或pH试纸 检测，并调 节溶液的pH 在7. 0左右0 . 2mol/L 的NaHPQ溶液将 31 . 21 g 的 NaHPQ 2Hz0充分溶解于1000 mL的蒸馏水中 充分溶解pH约为7 . 0的 20mmol/L磷酸缓 冲液取61 mL步骤中配制的NaaHPQ溶液与39 mL步骤中配制的NaHPQ溶液混合3

8、. 1 . 2丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺的配制及注意事项将29 g丙烯酰胺和1 g N, N-甲叉双丙烯酰胺溶于总体积为 70 mL的水中，搅拌过夜使之 充分溶解。注意事项： 丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，因此， 操作时需要戴上手套和防毒面具，而且在通风橱内或通风处进行。价格较低的这两种药物中 含有一些金属离子，为除去这些金属离子，可以在丙烯酰胺溶液中加入大约0. 2倍体积的单床混合树脂，搅拌放置一夜后，再用Whatma n 1号滤纸过滤就可以纯化。储存期间，由于光或碱的催化作用，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，因此，应将配制 好的溶液置于棕

9、色瓶中，置于4 C保存，并且使用前应检查该溶液的pH,以确保pH不超过7.0。3. 1 . 3 SDS的配制及注意事项将SDS用去离子水配制成10%勺贮存液，于室温保存。注意事项： 市售的SDS化学纯度不 够，需要重结晶后使用。重结晶方法如下：称取20 g SDS,放入500 mL圆底烧瓶中，加半勺活性炭及300 mL无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝管。在水浴上加热至乙醇微沸， 回流约10min，用热过滤漏斗趁热过滤。滤液应透明无色。滤液冷却至室温后，移至-20 C过夜。第二天，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量-20 C无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥器中干燥或40 C烘箱

10、中烘干。3. 2凝胶色谱柱的制作和装填3. 2. 1凝胶色谱柱的制作取长100cm,内直径1. 6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞打孔宀挖出凹穴宀安装 移液管头部t覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插 入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留， 导致蛋白质分离不彻底。3. 2. 2凝胶色谱柱的装填计算并称取一定量的交联葡聚糖凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬 浮液。将色谱柱装置固定在支架上，将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，凝胶沉集后， 将溶剂放出至胶面不再下降，并且通过23倍柱床体积的溶剂（20m

11、mol/L的磷酸缓冲液，pH7. 0）使柱床稳定。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装填完毕后，立即用缓冲液 洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300 mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7. 0）充分洗涤 平衡12h。注意事项：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时不得 有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；液面不要低于凝 胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动，从而影响生物大分子物质的分离效 果；注意不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。4. 实验操作步骤及注意事项本课题的主要目的是运用凝胶色谱法对蛋白质进行分离纯化，以

12、下是实验操作流程。透析粗分离凝胶色谱t 拄的装埴样品的加 入和;先脱I纯度I鉴定样品的处理：取家兔只，为保证取血量，取其颈动脉血，按1:1加入抗电泳凝剂肝素（1250U/ mL）或适宜浓度的柠檬酸钠溶液（将 6 g柠檬酸钠溶于100 mL的生理盐水 中），若要过夜，温度须控制在4 C左右。在样品处理的流程中，第一步用到低速离心，而第 三步用到高速离心，这主要是因为血液中除有红细胞外，还有其他细胞及大量的物质，红细 胞与这些物质之间的密度存在较大的差异，用低速离心就能将他们分离开；而“分离血红蛋 白溶液”步骤中，溶液的主要成份的密度相对要接近些，因此需要用较高速的离心，才能将 这些物质初步分离。

13、搅拌好的混合液离心后明显分为 4层（如右图），由上至下依次是甲苯层、脂溶性物质的 沉淀层、血红蛋白的水溶液、红细胞破碎物沉淀。取其上清液，用滤纸过滤除去脂类，再使滤液在分液漏斗中静置 5min，出现分层，分离出下层的血红蛋白溶液。粗分离：将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋，按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7. 0）,透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质，二是使血红 蛋白处于缓冲液环境中，便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。纯化：可采用柱型为 Sephadex G75，柱体积为500 mL的色谱柱；加样量为 10 mL （约含 蛋白200 m g

14、）;用20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7. 0）进行洗脱，洗脱速度可控制为0. 5mL /min，即20 min /管。此时可用 A280的紫外线进行检测，如果测得的数值很高，说明蛋 白含量过高，此时需要进行稀释。下图是将每管取0. 5 mL稀释10倍后，用紫外线测量的结果（如下图）。由图中数值可知，33-38管对应的数值为血红蛋白的吸收值，选择此时的试管进行蛋白质纯度的鉴定是比较合适的。纯度鉴定：经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，以下是实验操作流程。来说，条带分明，目的条带清晰，无扩散，前沿比较直，说明实验结果比较好，样品比较纯, 下面为兔血实验的电泳结果图。5. 课时安排及实施建议本

15、课题可安排45课时。教师可在实验前配制好磷酸缓冲液，并购买或制作好凝胶色谱 柱，以备实验时使用。课时安排授课或实验内容补充说明第12课时讲授凝胶色谱法和电泳的基本原理透析和平衡凝胶 需要的时间较长， 可由教师完成； 电泳可由教师演 示完成第3课时进行样品的处理（洗涤、释放、分离和透 析）第4课时运用凝胶色谱法对血红蛋白进行纯化增加1课时通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白质 进行纯度鉴定由于大多数学校缺乏相应的实验设备，操作难度较高，因此，本实验可由教师以讲清实 验原理和演示操作为主，并配以相应的实验录像进行教学。6. 教学体会本课题的实验操作相对复杂，影响实验效果的关键环节之一是凝胶色谱柱的制作和装填， 对实验者的操作有很高的要求，建议有条件的学校直接购买商品色谱柱。由于甲苯是剧毒试 剂,不太适合在中学实验中使用，因