第十六节血红蛋白的提取及分离(一)

1、血红蛋白的提取和分离（一） 主讲：黄冈中学优秀生物教师王小敏 课题目标 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白； 2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 课题重点 凝胶色谱法的原理和方法。 课题难点 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 一、基础知识 （一）蛋白质提取和分离的原理 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 （二）凝胶色谱法（分配色谱法） 1、概念：根据蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行 分离的方法。 2、原理: 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，

2、路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 3、凝胶材料：微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道 4、分离过程: 丹1心*我门崛 血 混合物 上柱 r,洗% F脱 大分子流动快 小分子流动慢 收集 大分子 收集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 （三）缓冲溶液 1、作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液 pH值的影响，维持pH基本不变。 2、缓冲溶液的配制: 由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。 如HCONaHCQ NaHPG/NazHPO等 调节酸和盐的用量，可配制不同 pH的缓冲液。 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是

3、pH=7.0的磷酸缓冲液，目的是利用 缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察红色 和材料的科学研究活性。 （四）电泳 1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理: 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电 场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向 和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素 决定运动方向 电场作用力 形成阻力 决定运动速率 电荷性质 V 电何量 V V 分子形状 V V 分子大小 V V | 3、常用方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳: 理件口. ”

4、门上囲“;!肚0 105-15止血f尚电沐（左）被般电球期处01（） （1）在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳。 聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺和交联剂 N, N -亚甲基双丙烯酰胺在引 发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 Y 一 XH1 丙烯奁轉 + 0口 II HjC=CH-C 一 XH =CH-C - XH It o X.N-亚甲基XZ再烯梵博形璇交联） 1 HC C I 0 1 ch3 1 审、1 乜 C-CH HC-C 0存I H H1 t 1 匚尽 i HC-C | ch3 KN HC-C 0* 1 C地 1 ewer 1 秤

5、0 p駛朗材#竝料F台住 (2)原理： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少及分子的 大小等因素。加入SDS可消除净电荷对迁移率的影响，使蛋白质迁移速率仅取决 于分子大小。 (3) SDS作用机理: SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在 SDS的作 用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种 蛋白质形成蛋白质一SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原 有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别， 使电泳迁移率完全取决于 分子的大小。 (4)用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

6、测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分 子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置， 可 以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准 蛋白试剂出售。 电泳检测结果: （五）血红蛋白 在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个 a 肽链和两个B肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团， 可携带一分子氧或一 分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。 -返回- 同步测试 一、选择题 1凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是（） A. 改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B. 吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质

7、分子的移动速度 C. 将酶或纽胞固定在凝胶中 D. 与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度 2、 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（） A. 相对分子质量大的B.溶解度高的 C.相对分子量小的D.所代电荷多的 3、 缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变 A.温度B.pH C.渗透压D.氧气浓度 4、 电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。 A.相同B.相反 C.相对D.相向 AABB -END- 课外拓展 凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的，其中仪器、填料、联用技术、色 谱理论等方面的进展是和整个液体色谱的进展相关的。但是下面四个

8、研究动向 意义较大，值得注意。凝胶色谱法分析仪器通过与其他仪器联用，解决凝胶色 谱法测定高聚物分子量分布从相对法向绝对法过渡。测定高聚物分子量分布是 凝胶色谱最重要的应用。试样先根据分子体积（即分子量）分离后再检测各组 分的分子量及含量。 在凝胶色谱中试样的分离是在色谱柱中进行的，被分离后的组分在流出柱 子时就同时连续地用浓度检测器和分子量检测器分别检侧各组分的浓度和分 子量，把两个检测器的输出讯号用记录仪记录后即得反映分子量分布的凝胶色 谱曲线。过去由于没有比较灵敏和瞬时响应的分子量检测器，因而利用一组不 同分子量的标样来标定色谱柱，然后从分子量算出体积的标定曲线来作数据换 算。这种用相对方

9、法来检测分子量虽然暂时解决了问题，但是随之而来的是实 验工作量增加以及数据处理方法上存在困难。实验数据的可靠性在很大程度上 决定于标定曲线、标样分子量数值以及数据处理方法的可靠性。其中色谱柱分 离效率不理想所引起的色谱峰加宽效应的改正，不但实验方法比较烦琐，而且 数据处理也比较复杂，需要用电子计算机来计算。所以虽然文献中已经推荐许 多据说是比较满意的计算方法，但这总不是一个根本解决的方法。只有真正找 到绝对分子量检测器，问题才算较好解决。原有的许多分子量测定方法，由于 不能做到足够灵敏的瞬时响应而未能成功地在凝胶色谱上应用。凝胶色谱柱最 近Ouano用激光小角光散射仪（LALLS来作分子量检测

10、器得到比较好的结果。 实验数据不需要标定曲线，也不必进行峰加宽改正。 由于激光的准直性较好，强度较大，可以允许在较小的角度下测量较稀溶 液的散射光强，由此可以直接计算出平均分子量的近似值而不需要象经典光散 射那样实验数据还要对浓度和散射角度向零作双外推。实验上，凝胶色谱仪和 激光小角光散射仪联用后，还可与计算机直接联接进行数据处理。在一次实验 进行完毕后，所需要的数据可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的数 值。激光小角散射仪已开始商品化，预计不久将会有更多的研究工作，来说明 已经在何种程度上解决了凝胶色谱的相对测定过渡到绝对测定。 凝胶色谱中的浓度检测器和通常的液体色谱一样仍然是一个薄弱环节，继 续在寻找更理想的检测器。目前最常用的仍然是示差折光检测器和紫外检测 -END- 高考解析 例、下列对有关实验的叙述，不正确的是（） A. 血红蛋白的提取和分离实验中使用的交联葡聚糖凝胶G-75,其中“75”表 示每克凝胶膨胀时吸水7.5克 B. 在色素的提取和分离的实验中，叶绿素 b在层