生物技术本科毕业论文PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用

1、湖北中医药大学本科生毕业论文 题 目：pcr方法在apoe基因敲除小鼠 基因型鉴定中的应用 姓 名： 学 号： 专 业： 生物技术 年 级： 2008级 实习单位： 武汉大学心血管病研究所 指导老师： 完成日期： 2012 年 5 月 1 日pcr方法在apoe基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用 作者 肖明瑶 指导者 张艳摘 要 目的 为apoe基因敲除鼠探索快速、简单的基因型pcr检测方法。方法 设计两对引物扩增野生型 apoe基因和apoe缺陷突变基因的dna片段，用pcr仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用pcr鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的 southern blot

2、方法检测得到的基因型结果比较。结果 野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用pcr方法获得的apoe基因分析结果与经典的southern blot方法获得的结果完全一致。结论 用pcr方法分析apoe基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。 关键词 聚合酶链反应 基因型 基因打靶 载脂蛋白e genotype identification of apoe gene knockout mice with polymerase chain reactionobjective this study was

3、to explore a simple and quick polymerase chain reaction（pcr）method for genotyping of apoe knockout mice.method two pairs of primers were designed to amplify genomic dna fragment of wild-type apoe gene and the same region on apoe targeting veceor respectively.a gradient pcr strategy was used to test

4、the best annealing temperature. results a 155bp band was found in wild-type apoe mice,a 245 bp band in homozygous mutated apoe mice and both bands in hetemzygous mice.the genotyping results were completely coincided with those from typical southern blot. conclusion pcr is a simple,fast and practical

5、 method for the genotyping of apoe gene knockout mice.key words poiymerase chain reaction genotype gene targeting apoe 载脂蛋白(apolipoprotein，apoe)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏apoe则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化(atl-rosclerosis，as)病灶形成。apoe基因敲除小鼠亦称apoe基因缺陷小鼠，由美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室应用胚胎干细胞基因敲除

6、(gene knockout)技术于1992年培育成功；这种小鼠无论正常或高脂饮食均可形成严重的高脂血症及as病灶。此后，各国学者利用apoe基因敲除小鼠在高脂血症及as的发病机理和治疗措施等方面做了许多卓有成效的研究。为了深入研究基因敲除小鼠表型的改变，基因敲除动物在用于实验研究前，必须准确、及时地进行基因型鉴定。由于需要鉴定的动物数量多，工作量大，而传统的southern blot方法费时、昂贵，又涉及同位素可能对环境的污染，不便于进行大规模的动物筛选。我们采用聚台酶链反应(poiymerase chain reaction，pcr)技术分析apoe基因敲除小鼠基因型，旨在为apoe基因敲

7、除鼠的基因型鉴定探索一种快捷、准确和廉价的方法，并为其他基因敲除动物的基因型鉴定提供参考。材料与方法1.材料1.1 apoe基因敲除小鼠 1.2 仪器 pcr仪（biometra t-gradient thermoblock、bioneer）电泳仪（bio-rai）、离心机（sigma 1-14ed）、离心机（sigma 1-14ed）bio-rad凝胶成像系统1.3 试剂 gotag system（promega）、引物（上海生工）、10*tbe缓冲液(?)、琼脂糖、marker（neb）、eb、宝生物la taq酶、蛋白酶k（promega）tris-hcl（amresco分装）、edta

8、(amresco分装)、sds（国药集团化学试剂有限公司）2.实验方法2.1 pcr引物设计：以正常野生型小鼠apoe基因组dna序列为模板，设计第一对引物oimr0180与oimr0181 (5gcc tag ccg agg gag agc cg 3，5 tgt gac ttg gga gct ctg cag c 3，以检测小鼠野生型apoe基因，pcr扩增片段长度为155bp。以apoe基因打靶载体中取代apoe基因的新霉素抗性基因cdna序列为模板，设计第二对引物oimr0180与oimr0182 (5gcc tag ccg agg gag agc cg 3，5gcc gcc ccg a

9、ct gca tct 3)，以检测发生缺失突变的hsf1基因，pcr扩增片段长度为245 bp。2.2 采样与消化：剪apoe基因敲除小鼠脚趾,杂合子小鼠脚趾以及野生型小鼠脚趾各一个，分别放入无菌、号15 ml eppendorf(ep)管中，加消化缓冲液17ul 和蛋白酶k3ul，置于55空气恒温摇床振摇消化3 h或过夜，然后置pcr仪中99摄氏度5分钟失活sds，100度失活蛋白酶k，13000r /min离心1min，取上层富含基因组dna的样品加入500ul无菌水作基因型检测备用。2.3 pcr步骤：取200ul无菌ep管18支，编号1至18，各加入总体积为20ul的pcr混合缓冲液:

10、reaction componentvolume (l)final concentrationtotal volume (l)ddh2o12.26-12.2610 x ab pcr bufferii1.201.00 x1.2025 mm mgcl20.962.00 mm0.962.5 mm dntp0.960.20 mm0.9620 um oimr01800.300.50 um0.3020 um oimr01810.300.50 um0.3020 um oimr01820.300.50 um0.305 mm dna loading dye1.660.69 mm1.665 u/ul taq dn

11、a polymerase0.060.03 u/ul0.06dna2.00-2.00放入pcr仪运行以下方案。2.4 pcr梯度方案：各取2ul杂合子基因组的样品加入编号1至9的ep管中，将ep管放入pcr仪，设置以下程序：step #temp ctimenote1943 min-29430 sec-350-7040 sec-4721 minrepeat steps 2-4 for 35 cycles5722 min-将扩增产物电泳，将扩增产物电泳，根据凝胶上清晰条带对应的扩增管号所在pcr仪上的位置，用pcr仪梯度计算功能确定最佳退火温度。2.5 pcr鉴定方案：往10、11、12号ep管加入

12、含杂合子基因组dna，往15、16、18号ep管加入含野生型基因组dna，最后向13、14、17号ep管加入含纯合子基因组dna的待测样本运行以下程序：step #temp ctimenote1943 min-29430 sec-35940 sec-4721 minrepeat steps 2-4 for 35 cycles5722 min-2.6 琼脂糖凝胶电泳： 用1*tbe电泳缓冲液配置1.0琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶冷却至50时加入一滴eb。待凝胶板充分聚合并冷却后，取8ulpcr产物点样，然后180v电压电泳35min，电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统照相。3.实验结果3.1 p

13、cr梯度方案扩增的apoe基因敲除鼠杂合子基因组dna，电泳图像见1图。泳道2、3、4在245bp处有条带但不清晰，在155bp处无特异性条带。泳道5、6在155bp及245bp处均有不清晰的条带。泳道7、8、9、10在155bp及245bp处均有清晰的特异性条带。通过pcr仪的梯度计算功能显示出泳道1至9的退火温度分别为：泳道2为50.0、泳道3为51.2、泳道4为53.4、泳道5为55.2、泳道6为57.3、泳道7为59.3、泳道8为61.5、泳道9为63.9、泳道10为66.6。泳道1和泳道11为100bp maker。3.2 pcr鉴定方案扩增的apoe基因敲除鼠基因组dna待测标本，

14、获得清晰度和特异性均较好的电泳图像，见图2泳道5、6、9仅在245bp处有条带，表示其基因型为apoe基因敲除鼠的突变纯合子。泳道2、3、4在155 bp和245 bp两处均有条带，表示基因型为apoe基因敲除鼠的杂合子。泳道7、8、10仅在155bp处有条带，表示其基因型为apoe基因野生型。泳道1和泳道11为100bp maker。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 245bp 155bp图1 梯度pcr扩增的杂合子基因组dnaflg.1 heterozygous genomic dna was amplified by gradient pcr1 2 3 4 5 6 7 8

15、9 10 11 245bp 155bp图2 采用pcr鉴定方案分析apoe基因敲除鼠的基因型flg.2 genotyping analysis of apoe knockout mice using pcr with degressive annealing temperature讨论基因敲除技术是近年来在生命科学基础研究领域的重大突破。它是利用现在分子生物学，通过构建一段突变或缺失的同源媒介基因，与受体细胞基因组中序列相同或相近的正常细胞因子基因进行同源重组，从而整合到受体细胞的基因组中获得同源重组后的基因，并筛选出所需要的突变或缺失基因，经鉴定后将此基因用显微注射或电穿孔技术导入胚胎肝细胞

16、，寄养于假孕的动物体以得到嵌合体。嵌合体再将突变或缺失的基因遗传给子代杂合子，杂合子相互交配可得到野生型、杂合子和突变型。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）方法是80年代发展起来的一种体外扩增核酸的方法。利用pcr方法可从基因组dna或其他模板dna扩增dna分子，经扩增后直接从染色的凝胶电泳中见到清晰的区带。基因敲除鼠的基因型鉴定一般采用经典的southern blot方法，牵涉到标本的消化、dna提取和酶切、凝胶电泳分离、转膜、探针标记及杂交等复杂步骤。此种方法虽然具有100的准确性，但工作周期长，而且步骤繁多、费用高并带来放射性同位素对环境污染的危

17、害性。在apoe基因敲除鼠的基因型鉴定中，pcr方法较southern blot方法具有显著的优越性，扩增只需几小时，靶dna只需ng甚至fg，显示出速度快、灵敏度高、准确性强并可同时操作大量的标本，适用于基因敲除鼠的大规模筛选。经反复验证，其准确性与southern blot方法所得结果完全一致。在pcr实验中，由于实验目的不一，常常需要反复试验，摸索最佳反应条件，在很多情况下需要及时对反应的有关参数作适当的调整，以达到掌握最佳条件，显著提高产物特异性和产量的目的。在此过程中叶常常会碰到一些问题，诸如扩增后无特异性产物或特异性产物很少；或出现非特异背景区带；或形成引物二聚体与特异性产物竞相扩

18、增等。在apoe基因敲除鼠的基因型鉴定中，采用梯度pcr发现：退火温度在59.3到66.6都可获得较好的特异性及较多的扩增产物。利用现代pcr仪的梯度功能，可从所用引物的tm值拟定退火温度范围，以免出现盲目采用退火温度所致无特异性产物或非特异性背景过高的问题。为了快速获得清晰度和分辨率都较好的分析结果，最终采用的pcr鉴定方案为94预变性5min，94变性30s，59退火30s，72延伸30s，返回第二步35个循环，72再延伸5min。结论pcr扩增基因的方法可广泛运用于基因型鉴定，与southern blot方法比较具有快速、准确、灵敏、费用低、费工少、可同时操作大批量标本等优点。参考文献1

19、 彭旷,杨永宗.载脂蛋白e及其基因敲除小鼠的研究进展j.心血管病学进展,2006年s1期.2 史济平，宋大新，杨渝珍，张景海，陈建华，崔景荣，楼滨.药学分子生物学.人民卫生出版社.2007：351353.3 bird je,giancarli mr.kurihara t.el al.increased severity of glomerulonephritis in c-c chemokine receptor 2 knockout mice.kidney int.2000;57(1):129-36.4 morano i.chai gx. baltas lg,et al.smooth-mus

20、cle contraction without smooth-muscle myosin.nat cell biol.2000;2(6):371-5.5林万明.pcr技术操作和应用指南.北京：人民军医出版杜，1993：2856.6 j萨姆布鲁，e f弗里奇，t曼尼阿蒂斯著，盘冬雁，黎盂枫译.分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1996.7 黄留玉.pcr最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社.现代生物技术与医药科技出版中心.2005.8 孔祥复，黄建东,鼠模型与人类疾病j,中国医学科学院学报，2001，23(1)：2 7.9 陈近利，陈吉棣有氧运动和膳食脂肪对apoe基因缺陷小

21、鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响中国运动医学杂志，2002，20(1)：58,15.10 陈近利，陈吉棣,有氧运动和膳食脂肪对apoe基因缺陷小鼠已经形成的动脉粥样硬化斑块的作用.中国运动医学杂志，2002，2o(3)：228231.11 陈近利，陈吉棣.有氧运动和膳食脂肪对apoe基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中srbl基因及蛋白表达的影响.中国运动医学杂志，2002，21(1)：l114.12 mannstadt m. the knowout mouse a revolutionizing model in biomedical research.med klin.1997;92(2):

22、558-60.13 陈广文,刘喜玲,肖献忠.pcr方法在hsf1基因敲除小鼠基因型分析中的应用j. 中国实验动物学报,2002年02期.14 孔祥复，黄建东.鼠模型与人类疾病j中国医学科学院学报，2001，23(1)：2 7.15 liu xue-dong, zheng dong, zhou yan-na2, mao wei-wei, ma jian-zhang.restriction endonucleases digesting dna in pcr buffer. journal of forestry research, 16(1): 58-60.转基因及基因敲除动物鉴定技术的研究进展

23、作者 吴立佳 指导者 巩军摘要转基因及基因敲除动物的建立,是一项复杂的系统工程,所涉及的环节众多,工作量大。而其中重要的一步,转基因及基因敲除动物的鉴定,则是对在此之前所进行的工作进行检验的关键。选用有效的方法,则能迅速、准确地鉴定出转基因及基因敲除。近年来,这方面技术发展迅速,许多新思路、新方法不断出现,本文对此进行了综述。关键词转基因动物基因敲除动物 鉴定技术早期所采用的转基因及基因敲除动物鉴定的方法是southern blot 也是目前所采用的最具有权威的动物基因型鉴定的方法。其具体步骤为提取待检动物的组织的染色体dna ,一般选择导入基因中的单一限制酶位点,消化后电泳,转膜后选择适当的

24、探针进行杂交,通过放射自显影获得结果。该方法的优点是结果明确可靠,缺点是操作繁琐、工作量大。因而目前用此方法进行转基因动物初步筛选很少见报道,主要应用于在使用其它方法如pcr等初步筛选后,做最后的确定。另一种较为常见的方法是斑点杂交。这一方法较为简单。提取待检动物dna点于硝酸纤维素膜。用探针杂交,放射自显影获得杂交结果。这一方法存在一些问题。如动物体内整合的外源基因与内源性基因有同源性时,往往出现假阳性。另一方面,在技术上,由于提取的染色体dna 较为浓稠,加之整合的拷贝数低,杂交效果有时不十分理想。因此,这一方法虽然十分简单,但使用于转基因动物筛选并不多。聚合酶链式反应(pcr)技术在分子

25、生物学领域的迅速应用使转基因动物的筛选工作大为简化,只需设计一对特异性引物,以提取的组织dna为模板进行pcr 即可。pcr的基本工作原理就是以拟扩增的dna分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在dna聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的dna合成。通过不断重复这一过程，可以使目的dna片段得到扩增。另一方面，新合成的dna片段也可以作为模板，因而pcr技术可使dna的合成量呈指数型增长。pcr包括7种基本成分：模板dna、特异性引物、热稳定dna聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dntp）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。模板dna：包括基因组dna、质粒d

26、na、噬菌体dna、预先扩增的dna、cdna和mrna分子等几乎所有形式的dna和rna都能成为pcr技术反应的板。除此之外，pcr反应还可以直接以细胞为模板。特异性引物：是一段与模板dna链结合的寡核苷酸片段，对于dna的扩增起到引发的作用。热稳定dna聚合酶：这是pcr技术实现自动化的关键。热稳定dna聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种dna聚合酶特点的混合型酶。脱氧核苷三磷酸（dntp）：是dna合成的原料，包括datp、dgtp、dttp、dctp。二价阳离子：常用到zn2+和mg2+,作为构成热稳定性dna聚合

27、酶的成分之一。缓冲液：一般使用tris-cl缓冲液，标准的为10mmol/l,并将其调节到8.38.8之间。一价阳离子：一般使用50mmol/l的kcl溶液，有利于改善扩增的产物质量。pcr的基本操作:pcr是一种级联反复循环的dna合成反应过程。pcr技术的基本反应由三个步骤组成：1. 变性：通过加热使模板dna完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板dna退火结合；3. 延伸：将温度升高，热稳定dna聚合酶以dntp为底物催化合成dna链延伸。以上三部为一个循环，新合成的dna分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环

28、后即可达到扩增dna片段的目的。由于pcr方法有时存在假阳性,特别是扩增出内源性片段,对转基因的筛选影响较大。因此,如何消除假阳性是一个重要问题。解决这一问题的主要途径是集中在引物的设计上。在目的基因上合成一对引物,所遵循的原则是：(1)尽量寻找所扩增片段与内源性基因无同源性的区域; (2)如果目的基因与内源性基因存在有比较高的同源性,所设计的两条引物应保证在3端有几个碱基与内源性基因不一致。在进行pcr 扩增时通过提高退火温度来消除非特异性片段; (3) 所设计的引物的位置选择,应选择在基因的外显子上,而不是选择在内含子上。尽管应用这些原则来设计引物,但有时鉴于导入的基因与动物内源性基因的高

29、同源性,仍给利用pcr 检测带来一定的假阳性,使检测的可信度下降。为改进这一不足,有人提出在导入基因的调控序列上合成一条引物,在目的基因上合成一条引物,从而排除了内源性扩增片段的可能性。但鉴于提取的染色体dna 的复杂度,有时仍能扩增出一些非特异性片段,这就要求在进行正式筛选以前,一定要设立阴性对照和阳性对照来改进pcr 的反应条件,确定出pcr 反应的最佳参数和循环参数。drew 等提出三引物方法来检测体系的可靠性,其在导入基因的调控序列上合成一条引物,在目的基因上合成第二条引物,同时在内源性基因上设计出一条引物,利用三引物同时进行pcr ,电泳检查结果阳性扩增出两条带(引物的设计使两条带有

30、不同分子量,以利于观察和辨别) ,而阴性结果出现一条特定的内源性电泳条带。使在检测的同时确保pcr 体系的可靠性,这使pcr 筛选检测转基因动物又向前迈进一步。常规的pcr 模板的制备方法是,提取染色体dna ,需要蛋白酶k消化过夜,酚氯仿抽提,乙醇沉淀等步骤。操作繁琐,需更换管多次,对于大量样品来说,增大了交叉污染的可能性。因此,如何制备更为简单有效的pcr 模板用于转基因动物检测也有许多研究者进行了探索。abbott 等提出改进制备模板的方法,在蛋白酶k 消化后,直接使异丙醇沉淀,煮沸灭活蛋白酶k,直接做pcr。使模板的提取在单管内完成。goodwin等利用微波裂解制备模板。ohhara

31、利用血液及毛发做pcr模板,这些都获得成功,但如何利用之,仍由个人爱好所定。如何利用pcr 进行有效的鉴定,一些学者仍在不断探索。mcknight等在转基因鼠的鉴定中,对显微注射的基因构件的调控序列上合成一条引物和在目的基因上合成第二条引物,进行pcr扩增,由于所扩增的片段中存在有人为加入于构件中的限制酶位点,对pcr 产物进行消化后,对产物的分子量进行判定,从而建立了5 个转基因鼠系。尽管这一方法可行,但有时pcr 产物在用限制酶消化后,会出现一些难以解释的结果,如多出一条或两条电泳带。作者在鉴定人g2gsf 转基因小鼠中,对pcr 产物进行酶切鉴定时就曾出现这一问题,为了进一步判定是否是阳

32、性转基因鼠,又对pcr 产物进行了southern blot 分析,从而确定出其正确性。与提取的染色体dna 做southern blot 分析的权威的转基因鼠鉴定结果获得一致的结论。这一方法的可靠性也已为一些作者所采用。该方法的优势显而易见, (1) 方便快捷,以往的方法在pcr 获得阳性鼠的基础上需做基因组southern blot 分析,这要求从鼠尾提取的dna 不仅纯度高、质量好,而且量大。有时往往不易做到。限制酶消化的好坏也影响southern 杂交的结果,这些为鉴定工作带来不便。(2) pcr 扩增产物产量一般比较高,方便做酶切分析和southern 杂交。(3) pcr 所扩增的

33、外源基因片段同内源性片段序列比较,一般总可以寻找到单一的酶切位点,这要求在引物的设计时要充分地考虑到检测问题,从而使后序工作简单化。与此同时,一些新的鉴定转基因动物的方法也在不断出现。尽管这些方法仍有待进一步研究和完善,但无疑有了新的开端。kuipers等利用染色体原位杂交的方法鉴定转基因猪。有人用此方法鉴定转基因鼠的杂合子和纯合子。这一方法虽然操作较为复杂,但其独到之处在于其能确定出外源基因在染色体上的整合位点以及整合状态。he等利用pcr 筛选转基因鼠的同时,将阳性转基因鼠的pcr 产物克隆于载体,对pcr 产物进行了序列分析。尽管繁琐,但其可以完整无误地鉴定出转基因的整合,同时又可以确定

34、出在整合时一些碱基所发生的突变,以及导入的基因由于动物体内特定机制的作用导致的导入片段的缺失等。其优点不言而喻。卢一凡等提出利用琼脂糖凝胶直接杂交鉴定低拷贝数转基因的方法,消除了常规southern blot方法中因转膜不完全而造成的低拷贝数转基因鼠的丢失。kuipers 等在pcr 扩增初步筛选出转基因鼠的情况下,利用rt2 pcr 对转基因鼠进行鉴定,从rna 水平确定出转基因的存在。最近,几个研究小组已克隆出酪氨酸酶的编码基因,绘制的图谱表明该基因位于鼠的c 位点。该酶是黑色素生物合成链中的一个关键酶,该基因可援救c 位点的突变以及阻滞白化的发生。当对几个白化鼠品系进行显微注射后,产生的转基因鼠在皮肤和眼的颜色上与非转基因鼠表现出差别。在出生后即可肉眼鉴定。一些研究小组现已用这一特性做为转基因整合的一个标记。将酪氨酸酶的编码基因与其他目的基因共注射可导致两者在染色体单一位点共整合。利用白化品系的试验表明,70 %或更多的转基因鼠表现出颜色反应。这一方法结合pcr 将使转基因动物的筛选和鉴定工作强度得到降低。然而面临的问题是,表现的皮肤颜色与该基因的表达量有关,有时难以分辨