问答题整理带复习资料

1、1. PCF反应体系包括哪些内容？基本反应过程是什么？内容：模板、引物、TaqDN/聚合酶、原料、Mg2+缓冲液、双蒸水 基本反映过程：变性退火延伸检测DNA变性（90C-96 C）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链 DNA 退火（60C -65 C）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。延伸（70C -75 C）:在Taq酶（在72C左右，活性最佳以dNTP为原料，从引物的3端开始以从5一3端的方向延伸，合成与 模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。检测2. 限制性内切酶的活性受什么因素的影响？ DNA分子的纯度 限制酶的浓度 D

2、NA分子的构型 DNA分子的甲基化程度 酶切反应的时间与温度 缓冲液的选择3. 作为基因工程载体的条件是什么？1 ）具有一个或多个限制酶切点 , 以供外源基因插入其中 ;2）具有标记基因 , 以鉴定重组是否进入受体细胞 ;3）能自我复制 ,否则可能导致重组丢失 ;4）对受体细胞无害 ;5）大小应适合 , 以便提取和在体外进行操作 ,太大不便操作 .4. 基因工程诞生的理论基础是什么？、20世纪中三个基础理论的重大突破 , 是基因工程的诞生的理论基础 .1、DNA是遗传物质的证明.2、DNA双螺旋结构和中心法则的确立.3、遗传密码的破译 .技术上的三大发明 *（3酶 2体）1. 限制性核酸内切酶

3、的发现与DNA切割2. DNA连接酶的发现与DNA片段的连接3. 载体的研究与应用5. 构建载体的一般过程是什么？A目的基因的分析1.开放阅读框分析2.酶切位点分析B载体的选择与分析1.多克隆位点分析2.标记基因分析3.启动子及其他筛选 标记分析C连接体系与连接时间的确定6. 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优点与缺点？优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子生物学 等方面背景知识清楚。并且大肠杆菌已经发展成为一种安全的基因工程试验 体系，易于批量生产。缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；细菌不具有对真核基因的蛋白进行修饰的机制，导致真核基因表达出的蛋白

4、无法表现活性；外源真核基因表达的蛋白往往被细菌当作异己给降解掉7. 如何有效提高外源基因的表达效率？ 提高外源基因表达效率的途径有很多，可以归纳如下： 提高启动子强度。 缩短启动子同克隆基因间距离。 高效的翻译起始序列。 高效的转录终止区。 提高质粒拷贝数及稳定性。用以下方法提高翻译水平：调整 SD序列与AUG间的距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加 mRN的稳定性的。 减轻细胞的代谢负荷：诱导表达；表达载体的诱导复制。 提高表达蛋白的稳定性，防止其降：克隆一段原核序列，表达融合蛋白；采用某种突变菌株；表达分泌蛋白质。8. RACE技术原理与方法RACE是基于PCF技术基础上由已知的一段cD

5、NA片段，利用锚式PCR快速扩 增cDNA末端从而获得已知mRN舶一段小序列与3 或5的cDNA序列技术。9. 3 RACE技术原理与方法利用mRNA勺3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有 SMART 寡核苷酸序列通用接头引物的 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物反转录合成标准 第一链cDNA然后用一个基因特异引物 GSP1(gene specific primer，GSP 作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物 UP(Muniversal primer ， UPM作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来。10

6、. 5 RACE技术原理与方法先利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以 Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MML作用下，反转录合成标准第一 链cDNA利用该反转录酶具有的末端转移酶活性， 在反转录达到第一链的5 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMARTS核苷酸序 列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以 SMART?列为模板继续延伸而 连上通用接头(见下图) 。然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM(universal primer ，UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2 (GSP 2gen especif

7、ic primer ，GSP 作为下游引物，以 SMART!一 链 cDNA为模板， 进行PCR循环，把目的基因5末端的cDNA片段扩增出来。11. 理想质粒载体的必备条件 能在宿主细胞中进行独立和稳定的自我复制 具有合适的限制性酶切位点 具有合适的选择标记基因1. 有较小的分子质量与较高的拷贝数2. 具有两种以上的选择标记基因3. 缺失MOBS因(不懂)4. 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞进行自我复制和表达12. 核酸操作的基本技术有哪些？ 核酸的提取与纯化 核酸的检测与保存 核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交13. 合成cDNA第二链的主要策略有哪些？ 自身引导合成法 置换合成法 PC

8、F合成法 RT-PCR cDNA与载体连接14. PCF技术主要应用在哪些领域？ 核酸基础研究 基因测序 检测基因表达 转基因检测 研究未知DNA片段15. 真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍 ? 真核基因缺乏SD 序列不能直接在大肠杆菌内部翻译 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；细菌不具有对真核基因的蛋白 进行修饰的机制，导致真核基因表达出的蛋白无法表现活性 外源真核基因表达的蛋白往往被细菌当作异己给降解掉16. 限制性核酸内切酶的命名原则？ 一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成， 第四个字母表示菌株（ 品系）17. 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？ DNA

9、分子的纯度 DNA分子的构型 DNA分子的甲基化程度 酶切反应的时间与温度 缓冲液的选择18. 什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有何作用？Klenow酶KlenowFragment,又称Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I的大片 断。保留了 DNA聚合酶I的5 -3聚合酶活性和3 -5外切酶活性，但缺少 完整的Klenow酶的5 -3外切酶活性。由于其失去了降解5端引物的活性， 所以在基因工程中更有用1. 修复反应，制备平末端2. 制备 3标记探针19. 若已知某基因的功能及其相应的蛋白质核苷酸序列， 可通过哪些办法克隆该 基因？可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDN

10、A文库中筛选。或利用相应抗体从cDNA文库中克隆20. YAC载体有什么样的功能性序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个 DNAS制起点, 两个端粒。YAC能容纳长达几百KB的外源DNA大片段的插入更有可能包含 完整的基因，增大染色体的步移距离，减少所需克隆数目21 .什么是western印迹，其与southern印迹又何不同？Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后 用特异的抗体进行检测。他与southern的不同在于探针性质的不同，在western中使用的探针为抗体（蛋白质）22. 什么是蓝白斑

11、筛选法？蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。野生型大肠杆菌（E.Coli ）产生的B -半乳糖苷酶可以将无色化合物 X-gal（5-溴4氯-3-吲哚 -B -D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使 整个菌落产生蓝色变化。突变型大肠杆菌缺少完整的B-半乳糖苷酶，在含有互补片段质粒作用下，可形成完整的B-半乳糖苷酶，插入外源基因的质粒则破坏了半乳糖苷酶的编码，从而通过颜色变化筛选重组子。这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。 主要是在入载体的非必要区段 插入一个自带有大肠杆菌B半乳糖苷酶的基因片段， 携带有LAC基因片段的入载 体转入宿主

12、后，在含有 X-gal平板上形成浅蓝色噬菌斑。外源基因插入 LAC 后，丧失分解Xgal的能力，形成白色噬菌斑。便于筛选23. 粘性末端链接法的不足 载体易自身环化 难插入特定基因 大片段DNAB组率低 同一种限制酶产生的黏性末端不易定向克隆24. 什么是同聚物加尾连接法？有哪些优缺点？同聚物加尾法是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的 3端加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏粒末端，DNA与载体间要加上互补的dT 优点不易自身环化链接效率高，因为是互补的黏性末端任何一种方法制备的DNA都可用此法连接缺点繁琐尾巴影响基因表达25. 重粗DN/技术有哪些基本步骤? 获得目的基因 与克隆载体连接 转化

13、 对转化子筛选与鉴定 培养或的产物26. 获得目的基因常用的方法有哪些? 从基因文库中提取 PCF技术 人工合成27. 常用的抗生素标记有哪些？氨苄青霉素抗性基因 ampr 四环素抗性基因 tetr 氯霉素抗性基因 cmr 卡那 霉素和新霉素抗性基因 kanr28. 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？DNA电泳常用的支持介质有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 .琼脂糖凝胶的凝胶孔径大，适合大分子 DNA电泳和需要快速简单分析的 DNA电泳，电泳方式一般采用水平潜水电泳。优点是快速简单，但分辨率不 是很高，对于差异较小的DNA片段难以分辨。聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于

14、1Kb的DNA片 段和DNA序列分析.其装载的样品量大，回收DNA屯度高.长度仅相差0.2%（即 500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离.一般说来，分离鉴定小于 1000 个核苷酸的核酸片段可用聚丙烯酰胺电 泳，分离鉴定0.1-50kb的DNA片段可用恒场常规琼脂糖电泳，而分离鉴定大 于 50kb 的DNA片段则需采用脉冲场琼脂糖电泳。29. 构建cDNA文库的一般步骤 mRNA勺分离纯化 cDNA勺合成 cDNA与载体连接 噬菌体颗粒包装及导入宿主细胞中繁殖30. DNA双脱氧链终止测序法的基本步骤原理：双脱氧的核苷酸是人造的分子，这种分子糖环的2和 3 碳上都没有了羟基基团，而在天然分

15、子中糖环的 3碳上有一个羟基。在DNA复制过 程中，新掺入的碱基按碱基互补配对原则是天然三磷酸核苷酸，用它的 5- a -P同生长链的前一个核苷酸的3羟基连接。但是，若进入的核苷酸是双脱 氧的，则由于3没有羟基而影响下一个磷酸二酯键的形成，导致 DNA复制终 止。方法：将待测序的单链DNA勺模板、引物、四种单脱氧碱基和DNA聚合酶 分成四管，在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧 碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。 如此每管反应体系中便合成以共同引物为 5 端，以双脱氧碱基为 3 端的一系 列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳，

16、以分离长短不 一的核酸片段 （长度相邻者仅差一个碱基 ），根据片段 3 端的双脱氧碱基，便 可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 考点 双脱氧链终止法的原理和方法。 英国剑桥大学分子生物学实验室的 F.Sanger在1977年发明了用DNA聚合酶 的双脱氧链终止原理测定DNA勺序列的方法。由于这种方法要求使用一种单 链DNA模板和一种适当的DNA引物，因此也被称为引物合成法或酶催引物合 成法。31. 什么是包涵体，以及以此方式表达蛋白的优点在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集 聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包 涵体（ Inclusi

17、on Bodies ，IB ）。（1）异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，如果重 组蛋白质以包涵体形式表达，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵 抗蛋白质酶的攻击；（2）包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用 考虑蛋白质的失活问题；（3）包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶 蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包 涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离；（4）有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导 致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质由于 丧失了生物活性从而可以

18、高效大量地表达；（ 5） 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性，含有 包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率，不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后 使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。32. 32. 大肠杆菌载体表达系统 DNA复制及载体选择系统 外源目的基因的转录系统 蛋白质的翻译系统LAC与TAC表达系统：以LAC操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统PL与PR表达系统：以噬菌体早期转录启动子 PL与PR构建的表达系统T7表达系统：利用大肠杆菌 T7噬菌体转录系统构建的表达系统33. 天然质粒的性质 质粒的组成与构型：可自我复制并传代线性、环形（环形双链 RNA环形双链DNA、其他 质粒的大小： 1200kb选择性质粒的DNAM制：松弛、严紧质粒的不亲和性显性质粒隐性质粒34. 外源基因在大肠杆菌的表达形式分为可溶性蛋白与不溶性蛋白两种 不溶性：包涵体（在大肠杆菌细胞质中、可溶性：融合蛋白 寡聚型外源蛋白和整合性蛋白35. 构建入噬菌体克隆载体的基本技术路线去除入噬菌体的