细胞克隆形成实验（干货分享）

1、细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有以上的细胞，大小在。3-1。0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力.各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测.细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆.而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大：.文档交流 仅供参考.一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱,转化

2、细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。.文档交流 仅供参考.实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验（a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞（b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系.文档交流 仅供参考.平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用2胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10胎牛血清的DMEM培养液中备用。.文档交流 仅供参考.2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10m 37预温培养液的皿中，并轻轻转动，使

3、细胞分散均匀。置375% 及饱和湿度的细胞培养箱中培养23周。.文档交流 仅供参考.3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗次.加多聚甲醛固定细胞5mL固定5分钟。然后去固定液，加适量GISA应用染色液染1030分钟，然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。.文档交流 仅供参考.4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。.文档交流 仅供参考.克隆形成率 （克隆数接种细胞数）10%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿.试验成功的关键

4、是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。.文档交流 仅供参考.平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分散得好,不能有细胞团，接种密度不能过大.文档交流 仅供参考.软琼脂培养克隆形成试验基本步骤:（1）取对数生长期细胞,用.25胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DME培养液调整细胞密度至1106细胞/。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。.文档交流 仅供参考.（）用蒸馏水分别制备出2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后，

5、维持在4中不会凝固.文档交流 仅供参考.(3)按：1比例使1.的琼脂糖和2ME培养基（含有2抗生素和%的小牛血清）混合后,取3m混合液注入直径m平皿中（10cm平皿加10L），冷却凝固，可作底层琼脂置O2温箱中备用。.文档交流 仅供参考.(4)按1:比例让7的琼脂糖和2DMM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入。2L的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1。2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层.待上层琼脂凝固后，置入375CO2温箱中培养1014天。.文档交流 仅供参考.(5）把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,

6、琼脂温度不宜超过40.接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。.文档交流 仅供参考.软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)将2%低熔点琼脂糖与2细胞培养基以1：1 的体积比混合制备0.6%的底层琼脂， 孔板中每个孔1。4ml 温室凝固,取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液,计数，并调细胞浓度为0000 个/m,将0.%低熔点琼脂糖与2细胞培养基以:1的体积比混合，制备0。3的上层琼脂,每孔加1ml 上层琼脂和10u单细胞悬液(约1000cel/we),混匀,室温凝固.置于37，5%CO2 的细胞培养箱中

7、培养-3 周,计数含5 个细胞以上得克隆,计算细胞集落形成率,poII 采集图像。.文档交流 仅供参考.注意事项.接种时细胞密度适度，不可过高。2软琼脂与细胞混合时温度不能超过40,否则将会烫伤死细胞；3。琼脂对热和酸不稳定,若反复加热,容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装；。细胞在进行克隆形成实验时要求有5%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响；.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养,生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10以上,但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为。5%5%,甚至无法形成单个克隆。因此,为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。.文档交流 仅供参考.。细胞接种存活率只表示