固定化反胶团漆酶及其在修复土壤DDT 污染中的应用

1、固定化反胶团漆酶及其在修复土壤 ddt 污染中的应用 赵月春 1，付蓉1，莫测辉2*，易筱筠3 1. 华南农业大学应用化学系， 广东 广州510640；2. 暨南大学环境工程系， 广东 广州510632；3. 华南理工大学环境科学与技术系， 广东 广州510640 摘要：采用吸附法将反胶团漆酶吸附在表面改性后的硅藻土上，制备固定化反胶团漆酶。探讨了反胶团漆酶固定化的影响 因素及其部分酶学特性，并对其在修复土壤 ddt 污染中的应用进行了研究。反胶团漆酶固定化的最佳温度是 35 ，载体 硅藻土的改性剂 tween-80 的加入量为硅藻土质量的 15%。固定化反胶团漆酶的最适作用温度为 35 ，最

2、适作用 ph 为 3.55.0；与游离漆酶相比，固定化反胶团漆酶的热稳定性和酸碱稳定性都显著提高。采用游离漆酶和固定化反胶团漆酶修 复 ddt 污染土壤，游离漆酶处理中 ddt 总量（ddts）的降解率为 50.53%，而固定化反胶团漆酶处理中 ddts 的降解率 高达 69.17%。固定化反胶团漆酶处理较游离漆酶处理的 ddts 降解率提高了近 20%。 关键词：反胶团漆酶；固定化；稳定性；ddt 中图分类号：q93 文献标识码：a 文章编号：1672-2175（2008）02-0606-05 漆酶（ec 1.10.3.2）是一种含铜的氧化酶，由 于漆酶能催化氧化多种环境污染物，因此，在环

3、境保护方面得到广泛的应用。有机氯农药 ddt 作 为一种高效的杀虫剂曾被广泛使用。ddt 具有高 毒、高残留、持久性和生物蓄积性等特征，对生 态环境和人体健康有严重危害1。尽管我国早在 1983 年就停用 ddt，但各地土壤中其检出率仍然 很高，一些地方甚至超标较严重，导致一些农产 品中的 ddt 检出率高达 100%2。因此，需要对 ddt 污染土壤进行修复，以确保农产品安全和人 体健康。 本文的前期研究表明，漆酶能有效降解残留 在土壤中的 ddt3。但是由于土壤中土壤胶体的 吸附、过酸或过碱以及土著蛋白酶的生物降解等 作用，可导致漆酶在使用过程中变性失活，进而 引起降解效率下降等问题，限制

4、了它的应用。为 了有效保持漆酶的活性和稳定性，很多学者研究 了漆酶固定化技术，主要的技术有吸附法 4-6、 交联吸附法7-9、共价键结合法10-12和包埋法固 定化酶13-15。在吸附法中通常是将漆酶直接吸附 在无机吸附剂上，如 gianfreda 等将漆酶直接固 定在蒙脱石、高岭土等载体上，保持了酶的活力 和稳定性16。但该方法仍存在酶与载体结合不牢 固，易脱落引起酶失活现象，使得降解效率降低 17。本实验采用先将漆酶制备成反胶团漆酶，然 后将反胶团漆酶吸附在改性硅藻土上的方法制备 固定化反胶团漆酶，并对固定化反胶团漆酶的部 分酶学性质以及其在修复土壤 ddt 污染中的应 用进行了研究。 1

5、 材料与方法 1.1 材料 供产漆酶的多孔菌购自中国科学院广州化学 有限公司。邻联甲苯胺（上海化学试剂总厂） 。 aot 气溶胶（浙江嘉善巨枫化工厂） 。tween- 80（上海申宇医药化工有限公司） 。sephadex g-75 葡聚糖凝胶（瑞典 pharmacia biotech 公司） 。供试 土壤赤红壤取自华南农业大学树木园，其质地为 粉沙质壤土，ph（水/土=2.5/1）为 5.35，有机质 为 7.89 g.kg-1，氮、磷、钾分别为 0.71、0.72、2.61 g.kg-1，ddt 未检出（检出限见 下文）。ddt 的 4 种组分 p,p-dde、o,p- ddt、p,p-dd

6、d 和 p,p-ddt 的标准物质购于美 国 supelco 公司。 1.2 方法 1.2.1 游离漆酶、反胶团漆酶和固定化反胶团漆 酶的制备 将多孔菌接种到以甘薯粉作碳源的好气纤维 分解菌固体培养基上活化，等菌种布满培养皿表 面时用 10 mm 的打孔器接种到马铃薯液体培养基 中，每 50 ml 培养液接入一片，放入 28 转速为 130 rmin-1的恒温摇床培养 9 d 后离心，取上清液 即得漆酶液。经盐析和 sephadex g-75 柱层析纯化 进一步提高其活力，制得游离漆酶18。 在 100 ml 容量瓶中依次加入 ph 为 4.6 浓度 为 0.02 moll-1的醋酸-醋酸钠缓

7、冲液 0.64 ml、酶 活为 37 u 游离漆酶液 2 ml 和含 0.1 moll-1 aot 气溶胶和 0.0125 moll-1 tween-80 的异辛烷溶液 97.36 ml，然后在磁力搅拌器上搅拌 12 h 得到含 水量为 15 的反胶团漆酶液。 取 3 g 的硅藻土作载体，加入一定量的 tween-80 对硅藻土进行表面改性，充分搅拌均匀 后加入含水量为 15 的反胶团漆酶液 25 ml，混匀 后在 30 下搅拌干燥，直至其成固体粉末状，制 得固定化反胶团漆酶。 1.2.2 游离漆酶和固定化反胶团漆酶的活力测定 以邻联甲苯胺为底物。取 0.1 ml 游离漆酶液 和 0.6 g

8、固定化反胶团漆酶，分别加入 0.1 moll- 1，ph 4.6 的醋酸盐缓冲液 3.4 ml，再加入 3.36 mmoll-1的邻联甲苯胺 0.5 ml，放入 25 恒温箱 中培养 25 min 后，放入 25 下 4000 rmin-1的离 心机上离心 5 min。采用 756mc 型紫外可见分光 光度计测 600 nm 处的光密度（od 值） （测定固定 化反胶团漆酶的酶活力时取上清液） ，以蒸馏水做 空白对照。酶活力以游离漆酶和固定化反胶团漆 酶与底物反应 30 min 后光密度的改变值表示，以 每分钟光密度增加 0.01 为 1 个酶活力单位（u）19。 1.2.3 固定化反胶团漆酶

9、对土壤中ddt 的降解试 验 ddt 溶液的制备：将 0.0547 g ddt 放入 100 ml 容量瓶中，用丙酮定容至刻度。此溶液 ddt 质量浓度为 0.547 mgml-1，置于 4 冰箱中保存 备用。在 50 g 过 60 目筛的土壤中加入 5 ml ddt 丙酮溶液，搅拌均匀，室内风干后再与 450 g 过 2 mm 筛的土壤混合均匀，即制得 ddt 污染土壤。 放置 4 周后进行漆酶修复试验。试验中保持土壤 的含水率为 15%左右。 每克土的加酶量为 6 u，设置对照处理、游 离漆酶处理和固定化反胶团漆酶处理共 3 个处理。 每个处理用土 15 g，设 3 个重复，分别置于烧杯

10、中试验处理 25 d。实验后将土壤风干，过 60 目备 测。试验前测定土壤 ddt 的 4 种组分 p,p- dde、o,p-ddt、p,p-ddd 和 p,p-ddt 初始质 量分数分别为 0.357、0.764、1.432 和 2.342 mgkg- 1，ddt 总质量分数（ddts）为 4.895 mgkg-1。 1.3 样品预处理与土壤中 ddt 的气相色谱分析 样品预处理和 ddt 的检测参照国标 gb/t1455093 方法进行20。 1.3.1 样品预处理 称取 10 g 土壤置于索式抽提器中，用体积比 为 11 的石油醚和丙酮混合液 100 ml 浸泡 10 h 后 抽提 6

11、h。同时做空白试验。将抽提液转移至分液 漏斗中，加入 10%的无水硫酸钠溶液，摇荡 1 min 后静止分层，取上层石油醚层并加入相当于石油 醚层体积 1/10 的浓硫酸分配 34 次，直至上下层 都呈无色为止。再加入剩余石油醚层体积一半的 10%无水硫酸钠溶液洗涤，直至石油醚层溶液至中 性，过无水硫酸钠脱水，浓缩，定容至 10 ml，待 测。 1.3.2 土壤中 ddt 的气相色谱(gc)分析 ddt 标准溶液含 p,p-dde、o,p-ddt、p,p- ddd、p,p-ddt 4 种组分，其质量浓度分别为 20、20、60.08、60 mgl-1，用丙酮（色谱纯）稀 释出 4 个浓度系列。

12、气相色谱仪为 hp5890，色谱柱为 hp-5，30 m0.320 mm（id）0.25 um；载气为 99.999%的高 纯氮气，气化室温度 220 ，柱温 195 ，检测器 （ecd）温度为 245 ，载气流速 2 mlmin-1。采 用不分流进样，进样量为 2 l。用回收率指示物 (2,4,5,6-四氯间二甲苯)控制整个操作流程的回收率， 抽提样品用回收标样控制整个操作流程的回收率。 指示物的回收率为 78%88.6%，ddt 总量 （ddts）的回收率为 88.4%98.7%。p,p- dde、o,p-ddt、p,p-ddd 和 p,p-ddt 的检测 限分别为 0.902、3.869

13、、2.847l 和 0.756 gl-1。 2 结果与讨论 试验数据采用 sas 8.1 软件分析，运用 dmrt 法和 duncan 法进行多重比较分析。 2.1 反胶团漆酶的固定化 2.1.1 温度的影响 温度对反胶团漆酶固定化的影响如图 1 所示。 从图 1 可以看出，在 3040 之间，固定化 反胶团漆酶的活力变化不显著，且活力都维持在 较高水平。但温度低于 25 或高于 45 ，酶活 力会受到影响，15 时相对酶活只有 77.03%（35 时的酶活力按 100%计算） ；50 相对酶活为 84.91%。温度影响分子热运动的速度，在相同的 固定化时间内,它将直接影响酶吸附到载体上的效

14、率，在较低的温度下进行固定化，固定化载体吸 附反胶团漆酶的量比较小；而固定化温度的较高 时，分子运动逐渐加剧，脱附速度加快，同时的 温度升高会引起酶失活变性，因此，反胶团漆酶 固定化的最佳温度是 35 。 2.1.2 tween-80 的影响 采用 tween-80 对反胶团漆酶的载体硅藻土进 1020304050 75 80 85 90 95 100 d cd c bc b ab ab a 相对酶活/% t/ 图 1 温度对反胶团漆酶的固定化的影响 （数据为平均值，具有相同字母的处理间无显著差异（p0.05） ） fig. 1 effect of temperature on the imm

15、obilization of reverse micelles laccase 行表面改性，其加入量对固定化反胶团漆酶酶活 力的影响如图 2 所示。 从图 2 可以看出，随着 tween-80 的加入量的 增加，固定化反胶团漆酶的活力逐渐增加且差异 显著，当 tween-80 的加入量为硅藻土质量的 15 时，表面改性效果最好，此时固定化反胶团漆酶 的活力最高，但 tween-80 的加入量的继续增加， 酶活力则开始下降，但差异不显著。因此，对载 体硅藻土的改性剂 tween-80 的加入量为硅藻土质 量的 15。 2.2 固定化反胶团漆酶的酶学性质 2.2.1 温度对酶活的影响及酶的热稳定性

16、 温度对固定化反胶团漆酶活力的影响如图 3 所示。 从图 3 可以看出, 在 25 40 之间固定化反 胶团漆酶的酶活力随温度变化不显著；30 35 时的酶活力略高于其他温度下的活力。固定化反 胶团漆酶的最适作用温度为 35 。 在不同温度下对游离漆酶和固定化反胶团漆 酶的热稳定性进行测定，结果如图 4 所示。 图 4 表明，固定化反胶团漆酶在 30 下保存 稳定，30 d 后活力还保留 92.1，而游离漆酶仅 保留 69.4；40 时固定化反胶团漆酶保存较稳 定，30 d 后活力保留 88.6，游离漆酶仅保留了 10.5；在 50 下保存 30 d 后固定化反胶团漆酶 活力保留 76.8，而

17、游离漆酶仅保留了 6.2。可 见固定化反胶团漆酶的热稳定性显著提高。 2.2.2 ph 对酶活的影响及酶的酸碱稳定性 ph 对固定化反胶团漆酶活力的影响如图5 所示。 由图 5 可见，固定化反胶团漆酶在 ph 3.05.6 时活力变化不显著，在 ph6.2 或 ph0.05） ） fig. 2 effect of tween-80 on the activity of laccase 图 5 ph 对固定化反胶团漆酶活力的影响 （数据为平均值，具有相同字母的处理间无显著差异（p0.05） ） fig. 5 effect of ph on the activity of immobilized

18、reverse micelles laccase 图 4 游离漆酶和固定化反胶团漆酶的热稳定性 fig. 4 thermal stability of free laccase and the immobilized reverse micelles laccase 图 3 温度对固定化反胶团漆酶活力的影响 （数据为平均值，具有相同字母的处理间无显著差异（p0.05） ） fig. 3 effect of temerature on the activity of immobilized reverse micelles laccase 2025303540 92 94 96 98 100 b

19、 ab ab a a 相对酶活/% t/ 051015202530 70 75 80 85 90 95 100 相对酶活/% 时间 /d 30 40 50 051015202530 20 40 60 80 100 相对酶活/% 时间 /d 30 40 50 0.050.100.150.200.250.30 70 80 90 100 c b b ab ab a 相对酶活/% tween-80/硅藻土/g.g-1 234567 75 80 85 90 95 100 b ab a a c b ab a a 相对酶活/% ph 团漆酶的酶活力较高。 不同 ph 时对游离漆酶和固定化反胶团漆酶的 稳定性

20、进行测定，结果如图 6 所示。 图 6 表明，固定化反胶团漆酶在 ph 3.55.0 时保存比较稳定，ph 4.5 时保存最稳定，保存 30 d 活力仅损失了 10.5。游离漆酶在 ph 3.0 下保 存最稳定，保存 30 d 活力损失了 28.2。可见， 固定化反胶团漆酶的酸碱稳定性也显著提高。 2.3 固定化反胶团漆酶修复 ddt 污染土壤 游离漆酶与固定化反胶团漆酶对 ddt 各组分 及总量的降解率如图 7 所示。 从图 7 可以看出，除 p,p-dde 外，与不加酶 对照相比，ddt 其它组分及总量在游离漆酶及固 定化反胶团漆酶处理中的降解率均显著提高，而 且在反胶团固定化漆酶处理中的

21、降解率显著高于 它们在游离漆酶处理中的降解率。不同组分降解 率有所 不同。对于 ddt 总量（ddts） ，在游离漆酶处理 中的降解率为 50.53%，在固定化反胶团漆酶处理 中的降解率高达 69.17%。固定化反胶团漆酶处理 较游离漆酶处理的 ddts 降解率提高了近 20%。 说明固定化反胶团漆酶对 ddt 各组分及总量的降 解优于游离漆酶。这是因为固定化反胶团漆酶是 先将分离纯化的游离态漆酶制备成亲水基向内而 疏水基向外的反胶团漆酶，再将其固定在表面改 性过的硅藻土上，能较好的保持漆酶的活性和稳 定性，从而提高了固定化反胶团漆酶对 ddt 的降 解效率。 对于组分 o,p-ddt、p,p

22、-ddd 和 p,p- ddt，它们在不加酶对照处理中的降解率为 6.48%25.88%；在游离漆酶处理中降解率为 42.00%62.36%；而在固定化反胶团漆酶处理中 降解率为 64.10%80.17%。 对于组分 p,p-dde，不加酶对照处理中的降 解率为 1.56 %。在游离漆酶处理中的降解率为- 1.20%。而在固定化反胶团漆酶处理中的降解率为 6.07%。这一结果也说明游离漆酶处理过程中有新 图 6 不同 ph 下游离漆酶和固定化反胶团漆酶的稳定性 fig. 6 stability of free laccase and immobilized reverse micelles l

23、accase under different ph p,p-dde o,p-ddt p,p-ddd p,p-ddtddts 0 20 40 60 80 100 化 降解率/% dd c c c c b b b b a a a a d 对照 游离酶 固定 酶 ddt组分 图 7 游离漆酶与固定化反胶团漆酶对土壤中 ddt 各组分及总量的降解 （数据为平均值，同一组分不同处理间具有相同字母者 无显著差异（p0.05） ） fig. 7 the degradation of ingredients of ddt and total ddt using free lacccase and immobi

24、lized reverse micelles laccase in the soil 051015202530 50 60 70 80 90 100 相对酶活/% 时间/ d ph=3.0 ph=3.5 ph=4.0 ph=4.5 ph=5.0 ph=5.5 ph=6.0 051015202530 20 40 60 80 100 相对酶活/% 时间/ d ph=2.5 ph=3.0 ph=3.5 ph=4.0 ph=4.5 ph=5.0 ph=5.5 的 p,p-dde 生成，从而使 p,p-dde 浓度略有增 大，降解率为负值。 3 结论 反胶团漆酶固定化的最佳温度是 35 ，载体 硅藻土的

25、改性剂 tween-80 的加入量为硅藻土质量 的 15。固定化反胶团漆酶的最适作用温度为 35 ，最适作用 ph 为 3.55.0；与游离漆酶相比， 固定化反胶团漆酶的热稳定性和酸碱稳定性都显 著提高。采用游离漆酶处理土壤 ddt 污染，ddt 总量（ddts）的降解率为 50.53%，而在固定化反 胶团漆酶处理中 ddts 的降解率高达 69.17%，固 定化反胶团漆酶处理较游离漆酶处理的 ddts 降 解率提高了近 20%，固定化反胶团漆酶对 ddt 各 组分及总量的降解优于游离漆酶。 参考文献： 1 marco j a m, kishimba m a. concentrations o

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35、tract: laccase in reverse micelles was immobilized on modified diatomite by physical adsorption. the immobilization conditions and characterization of the immobilized reverse micelles laccase were investigated. the remediation of ddt- contaminated soil with immobilized reverse micelles laccase was s

36、tudied. the optimal temperature was 35 and the optimal adding quantity of tween-80 added to diatomite was 15% of the mass of diatomite for immobilization of laccase in reverse micelles. the activity of the immobilized reverse micelles laccase was maximal at 35 and ph 3.55.0. degradation rates of tot

37、al ddt (ddts) was only 50.53% in soils treated with free laccase but up to 69.17% in soils treated with the immobilized reverse micelles laccase. compared with the free laccase, the degradation rates of ddts using the immobilized reverse micelles laccase increased about 20%. key words: reverse micel

38、les laccase; immobilization; stability; ddt 我的大学爱情观我的大学爱情观 1 1、什么是大学爱情：、什么是大学爱情： 大学是一个相对宽松，时间自由，自己支配的环境，也正因为这样，培植爱情之花最肥 沃的土地。大学生恋爱一直是大学校园的热门话题，恋爱和学业也就自然成为了大学生在校 期间面对的两个主要问题。 恋爱关系处理得好、正确，健康，可以成为学习和事业的催化剂，使人学习努力、成绩 上升；恋爱关系处理的不当，不健康，可能分散精力、浪费时间、情绪波动、成绩下降。因 此，大学生的恋爱观必须树立在健康之上，并且树立正确的恋爱观是十分有必要的。因此我 从下面几方

39、面谈谈自己的对大学爱情观。 2 2、什么是健康的爱情：、什么是健康的爱情： 1) 尊重对方，不显示对爱情的占有欲，不把爱情放第一位，不痴情过分； 2) 理解对方，互相关心，互相支持，互相鼓励，并以对方的幸福为自己的满足; 3) 是彼此独立的前提下结合； 3 3、什么是不健康的爱情：、什么是不健康的爱情： 1)盲目的约会，忽视了学业; 2)过于痴情，一味地要求对方表露爱的情怀，这种爱情常有病态的夸张; 3)缺乏体贴怜爱之心，只表现自己强烈的占有欲; 4)偏重于外表的追求; 4 4、大学生处理两人的在爱情观需要三思：、大学生处理两人的在爱情观需要三思： 1. 不影响学习： 大学恋爱可以说是一种必要

40、的经历，学习是大学的基本和主要任务，这两者之间有错综复杂 的关系，有的学生因为爱情，过分的忽视了学习，把感情放在第一位；学习的时候就认真的 去学，不要去想爱情中的事，谈恋爱的时候用心去谈，也可以交流下学习，互相鼓励，共同 进步。 2. 有足够的精力： 大学生活，说忙也会很忙，但说轻松也是相对会轻松的！大学生恋爱必须合理安排自身的精 力，忙于学习的同时不能因为感情的事情分心，不能在学习期间，放弃学习而去谈感情，把 握合理的精力，分配好学习和感情。 3、有合理的时间； 大学时间可以分为学习和生活时间，合理把握好学习时间和生活时间的“度”很重要；学习 的时候，不能分配学习时间去安排两人的在一起的事情，应该以学习为第一；生活时间，两 人可以相互谈谈恋爱，用心去谈，也可以交流下学习，互相