瘢痕成纤维细胞研究论文

1、瘢痕成纤维细胞研究论文目的观察钙网蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情 况。方法采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果瘢痕 和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表达CRT水平 (A:1.97 士0.15,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平 (A:1.43 士 0.12),差异有非常显著意义(P V 0.01);而在已融合的瘢痕 和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRT表达。结论瘢痕成纤维细胞内CRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及

2、钙存储等方面均有着积 极作用。Study on theexpressi ono fcalreticuli nin hypertrophicscar-derive dfibroblasts【AbstractObjectiveToi nv estigatetheexpressi on levela ndi ntracellulardis tributio no fcalreticuli n( CRT)i nhypertrophicscar-derivedfibro blasts(HSF)a ndn ormalski n-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsi ngan

3、 ti-CRTa ntibody,CRTwasdetectedi nH SFa ndNSFbyim muno cytoche mistrya ndELISAtech nique.ResultsCRTwasprese nti nthecytoplasma ndnu cleii nproliferat in gHSForNSFi nculture,butHSFpossessedsig n ifica ntlyhigherexpressi on levelofCRTtha nN SF(PV 0.01).Whe nthesecells(HSFa ndNSF)werefused, neitheri nt

4、racellul arnori ntra nu clearstai nin gforCRTwasobserved.C on clusio nlnH SFan dNSF,thedistributio no fCRTiswidespread.Becauseofitsab undant expressio ninH SF,wepostulatethatCRTasamultifu nctio nalprotein playsa ni mporta ntrole in Ca2sequesteri ng,i ntegri n-mediatedsig n alli ngan dcelladhesi on.【

5、KeywordsHypertrophicscarFibroblastCalreticuli nExpressi on增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS) 作为创伤及外科手术后常见且十分棘手的皮 肤组织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积 既是HS的重要组织学特征，也是HS发生、发展的物质基础。钙网蛋 白(Calreticuli n,CRT)最早是作为一种存在于非肌细胞内质网上的主要钙结合蛋白得以认识的1,近几年的研究发现：除具有钙离子 储藏作用外，CRT在参与并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极 影响2-5 ,同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中

6、 有着极其重要的价值6。我们通过CRT抗体并利用原位ELISA及免 疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外表达CRT水平，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探讨CRT在瘢痕成纤维细胞发挥异常生物 学活性功能中的作用。1材料与方法1.1组织标本增生性瘢痕及正常 皮肤组织标本均取自住院病人，年龄1740岁。患者在取标本前无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患； 瘢痕组织生长时间均在69个月之间。1.2主要试剂及物品准备羊 抗CRT抗体：Michalak博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及 OPD(Sigma公司)。细胞培养基：DME添加10%小牛

7、血清（上海华美生物技术有限公司）。96孔塑料培养板及100mn培养皿（丹麦Nunc公司）。1.3成纤维细胞培养手术切取增生性 瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min, PBS 洗3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量 10%、牛血清的DMEI培养基，37C 5%CO静止培养，3天后补充少量 培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液， 传代。 1.4CRT免疫细胞化学染色体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min, 0.3%双氧水反应5min, PBS再洗；二抗 血清 37C20min,抗 CRT抗体 37C作

8、用 45min, HRP兔抗羊 lgG37C 反应1h, DAB显色；显微镜下观察显色信号。1.5CRT原位ELISA检 测7选择第5代培养细胞为实验对象，用 0.25%胰蛋白酶消化后 收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100卩l接种于96孔培养 板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min,0.3%双氧水反应 5min, PBS洗;与 0.1%TritonX- 1004C 作用 3min 后， 进一步分别与5%J、牛血清（37 C、20min）、抗CRT抗体（37 C、1h）、 5%小牛血清PBS稀释的HRP兔抗羊lgG（37C、1h）反应；PBS清洗后 加入

9、OP*物液100卩l，作用30min后用50卩I1mol/L硫酸中止反 应。ELISAreader上读取492nm的P值。2结果2.1成纤维细胞初代 培养结果在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种 后2天见有部分贴壁，培养1周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘 爬出，2周后细胞在组织块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。2.2成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维 细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的CRT阳性表达；一旦细 胞生长融合后，在融

10、合区内的成纤维细胞中均未见有明显的 CRTTO性 信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤 成纤维细胞内，则仍有CRT勺阳性信号分布；就二种细胞内CRT的表 达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正 常皮肤成纤维细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当瘢痕及正常皮 肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融合时信号较弱。转此外，CRT在 瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞 浆、核膜及核内均有表达。2.3成纤维细胞CRT表达的ELISA检测结 果根据CRT免疫细胞化学染色结果，

11、我们对第5代瘢痕及正常皮肤成 纤维细胞(接种后培养16h)进行CRT表达的ELISA检测，其中正常皮 肤成纤维细胞组的CRT表达值为1.43 士 0.12(A)，瘢痕成纤维细胞组 为1.97士 0.15(A),二组间差异有非常著性意义(PV 0.01)。3讨论增 生性瘢痕是伤口上皮化愈合后组织内成纤维细胞异常活化即继续旺 盛增殖并分泌大量胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外间质所造 成的一种组织病理改变，有关瘢痕成纤维细胞为何异常活化一直是整 形烧伤外科领域里重点探索的课题之一。转化生长因子B 1、肿瘤坏死因子a、白细胞介素-1和类胰岛素生长因子-1等在增生性瘢痕组织内的过度表达一直被认为是引

12、起成纤维细胞异常活化不可忽视的 因素，但越来越多实验研究表明瘢痕成纤维细胞自身生物学特性改变 是触发其功能异常的关键8。我们通过对细胞内CRT勺表达检测， 进一步发现CRT不但在瘢痕成纤维细胞内分布广泛，而且其表达量明 显高于正常皮肤成纤维细胞内水平。 CRT乍为钙离子主要结合蛋白， 早期研究认为CRT主要是通过影响细胞内钙离子的储存与释放而影 响细胞的一些生物学活性效应，但近几年的研究结果表明CRT除上述 作用外，它在细胞迁移扩散及细胞内相关基因表达等方面均有直接的 介导和调节作用。1997年，Zhu等人9通过对B16细胞CRT表达 的深入研究发现实细胞内的 CRT分子常常与整合素粘附分子的

13、 a链 胞内区结合并成为双向传导细胞内外信号的复合体；Coppolino等人:5利用CRT缺乏而整合素表达正常的胚胎干细胞进行细胞体外迁 移粘附研究，证实在正常培养条件下干细胞的迁移扩散能力很弱，而 经转染CRTS因后，细胞的迁移粘附作用显著增强。因此，Coppolino 认为细胞内CRT与整合素粘附分子直接参与细胞的信号传导、粘附、 迁移扩散等生物学活性功能。Tsai等10曾利用体外结缔组织收 缩模型发现增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞在体外有着比正常皮 肤成纤维细胞更强的迁移扩12散能力，并认为其作用可能与细胞 内肌动蛋白丝积聚有关。笔者在博士后研究工作阶段却发现在相同培 养条件下增生性瘢痕

14、组织来源的成纤维细胞除有着较强迁移扩散能 力外，还具有高表达 B 1、a 1、a 2、a 3及a 4整合素粘附分子的特性11,从而提示瘢痕成纤维细胞的强迁移扩散能力与高表达整 合素粘附分子有关；而从本实验对CRT在瘢痕成纤维细胞内的表达情 况来看，细胞内其CRT表达并不属持续性表达，CRT的高表达期一般 是在细胞的迁移扩散阶段，而当细胞融合后细胞内CRT表达甚少。但 就与同一时期培养的正常皮肤成纤维细胞相比，瘢痕成纤维细胞内的CRT表达则显得更为丰富。因此，结合我们以往的研究工作结果，我 们认为：瘢痕成纤维细胞异常的迁移扩散能力是细胞内丰富的CRT整合素粘附分子表达及肌动蛋白丝积聚共同作用的结

15、果，其中积聚的肌动蛋白丝是其异常迁移扩散的重要动力来源，而有效表达的CRT及 整合素粘附分子则是细胞与细胞外间质之间迁移动力的传递媒介；另外，CRT的丰富表达对瘢痕成纤维细胞钙离子的储存、释放及其信号 传导等也有着重要的意义。参考文献 1KrauseKH,MichalakM.Calreticuli n.Cell,1997,88:439-443.2Tect orM,Zha ngQ,SalterRD.Beta2-microglobuli nan dcal nex incanin depe nden tlypromotefold ingan ddisulfideb on dformatio nin

16、classIhisto compatiblityprote in s.Mollmmu nol,1997,34:401-408.3LiuH,BowesRC,va n-de-WaterB,etal.E ndoplasmicreticulumchapero nesGRP78a n dcalreticuli npreve ntoxidativestress,Ca2disturba nces,a ndcelldeathi nren alepithelialcells .J BiolChem,1997,272:21751-21759. 4BurnsK,OpasM,MichalakM.Calreticuli

17、 nin hibitsglucocorticoid- but notcAMP-se nsitiveexpressi ono ftyrosi neami notra nsferasege n ein cultruedMcA-RH7777hepatocytes.MolCellBiochem,1997,171:37-43.5Coppoli no MG,WoodsideMJ,DemaurexN,etal.Calreticuli ni ses sen tialfori ntegri n-mediatedcalciumsig nalli ngan dcelladhesi on .Nature,1997,3

18、86:843-847.6Eggleto nP,ReidKB,KishoreU,etal.CI in icalreleva nceofcalreticuli nin systemiclupuserythematosus.L upus,1997,6:564-571.7Wi niskA,FosterC .I CAM-1expressio nin aspo n ta neouslytra nsformedhuma nkerati no cytecellli ne:Characteriza tio nbyasimplecell-ELISAassay.JI nvestDermal,1992,99:48-52.8T redgetEE,NedelecB,Scott-PG,etal.Hypertrophicscars,keloids,a n dco ntractures.Thecellulara ndmolecularbasisfortherapy.SurgC linN orthAm,1997,77:701-30.9ZhuQ,Zeli nkaP,WhiteT,etal.Calret iculi n-i ntegri nbidirecti on alsig nali n