枯草芽孢杆菌的研究与应用

1、枯草芽孢杆菌的研究与应用第4o卷第9期2009年9月东北农业大学journalofnortheastagricuhuraluniversity4o(9):111114sep.2009枯草芽孢杆菌的研究与应用李明,双宝,李海涛,王晴,高继国(东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030)摘要:枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌,能形成芽孢,是一些重要工业酶制剂的生产菌.由于其具有非致病性,分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础,所以应用十分广泛.文章通过总结归纳其在医药,农业和其他研究领域的应用现状,分析其应用中存在的问题和产生问题的原因,希望能够为从事此领域研究的人员提供参考.关键词:枯草杆菌;应用;

2、表达系统;细胞质融合中图分类号:$563.2文献标识码:a文章编号:10059369(2009)09一o11l-04progressandapplicationofbacillussubtilisindifferentfields/uming,shuangbao,lihaitao,wangqing,gaojiguo(collegeoflifesciences,northeastagriculturaluniversity,harbin150030,china)abstract:bacillussubtilisisoneofsomejndustriaiproductionenzymebacter

3、ia.andagrampositivebacteria,whichcarlformspores.becauseithasthebasisofnonpathogeniccharacteristic,theabilitytosecretetheproteinandagoodbasisforfermentation,ithasawiderangeofapplication.thispapersummarizedthestatusofitsapplicationinthefieldsofmedicine,agricultureandotherresearches,theanalysistheprobl

4、emsandthereasonsofproblemswithinitsapplicationwouldliketoprovideareferencetothepeoplewhoarestudyingonthisareakeywords:bacillussubtile;application;expressionsystem;cytoplasmintegration枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一类好氧型,内生抗逆孢子的杆状细菌,广泛存在于土壤,湖泊,海洋和动植物的体表,自身没有致病性,只具有单层细胞外膜,能直接将许多蛋白分泌到培养基中.在营养缺乏的条件下,枯草芽孢杆菌停止生

5、长,同时加快代谢作用,产生多种大分子的水解酶和抗生素,并诱导自身的能动性和趋化性,从而恢复生长.在极端的条件下,还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子ili.正是由于枯草芽孢杆菌无致病性,并可以分泌多种酶和抗生素,而且还具有良好的发酵基础,所以用途十分广泛.本文对枯草芽孢杆菌在医药,农业,科研方面的应用现状以及面临的一些问题及其产生原因进行了阐述.l枯草芽孢杆菌在医药方面的应用枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶,其中能够应用到医药领域的酶主要有丝氨酸纤溶性蛋白酶和脂肪酶两种.丝氨酸纤溶性蛋白酶,即纳豆激酶.此外,我国的豆豉纤溶酶和韩国的大豆发酵食品中分离的纤溶酶也都是枯草芽孢杆菌分泌的丝氨酸纤溶性蛋白酶的

6、一种,只是发酵用的菌株有些细微差别.1.1纳豆激酶的发现及应用1987年,日本学者经过对上百种食物的筛选,首次发现日本传统的大豆发酵食品一纳豆中含有溶解血纤维蛋白的成分,并将其命名为纳豆激酶收稿日期:20081212作者简介:李明(1983一),男.河北人,硕士研究生,研究方向为生物化工分离纯化.通讯作者:高继国,教授,硕士生导师,研究方向为生物大分子的分离纯化.e-mail:ga0jigu01964h0tmail.oonl?112?东北农业大学第40卷(nattokinase,nk).通过狗的模型试验及健康人群的体内研究,证明其除了具有显着的溶栓作用外,还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶

7、原激活剂的能力,从而间接地表现其溶栓活性.与传统的溶栓剂相比,nk具有不易引起出血,无抗原性,半衰期长,安全无毒且成本低廉和能口服吸收溶栓等优点,因而具有广阔的开发前景,可能成为新一代的溶栓药物2-31.1992年,nakamura等首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列,使得利用基因工程技术提高纳豆激酶活性及产量成为可能i4j.近年来,我国掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮,纳豆激酶的药用价值日益突出,通过利用基因工程菌生产纳豆激酶,致使对纳豆激酶基因的克隆,表达,纯化及表达产物的产量和活性方面的研究取得了很大进展.在我国传统大豆发酵食品豆豉中发现了类似纳豆激酶的高活力的纤溶酶,将其产生菌株鉴

8、定为枯草芽孢杆菌,并将豆豉纤溶酶基因克隆到了毕赤酵母中【51.与此同时,韩国也在其传统大豆发酵食品中发现了类似的纤溶酶.近期,陈哗等通过枯草芽孢杆菌培养,利用(nh)2s0沉淀,sephadexg100柱层析对该酶发酵液进行分离纯化,已经分离纯化出了枯草芽孢杆菌(bacillussubtiliszy21)溶栓酶61.以上研究证明,日本,中国及韩国先后发现的这3种纤溶酶应该均由枯草杆菌分泌的,只是菌株不同而已.1.2脂肪酶脂肪酶是一类能在油水界面上水解甘油三酯酯键的酶的总称,广泛应用于食品,生物医药,化工,化妆品以及生物柴油等传统与现代工业f.目前,褶皱假丝酵母(candidarugosa),霉

9、菌属等是脂肪酶工业生产的主要菌种,来源于枯草芽孢杆菌168的脂肪酶以其广泛的底物作用范围,较小的分子质量以及较高的等电点等优良酶学特性而日益受到人们的关注91.脂肪代谢最基本的酶是脂肪酶,其缺乏将会引起健康问题.通过脂肪酶的外部调节可达到助消化的目的.微生物脂肪酶被用来从动物和植物中获得多不饱和脂肪酸,而多不饱和脂肪酸作为生物药物和营养成分起着越来越重要的作用;游离的多不饱和脂肪酸及其单双甘酯又是用来生产各种药物(抗胆固醇,抗炎药)的原料.马吉胜从原始的枯草杆菌质粒pbd64出发,通过设计两段dna片段,引入了多个酶切位点和一个强启动子序列,构建了一个枯草杆菌脂肪酶高表达质粒pbsr2,并进一

10、步研究了这种酶的分子质量,酶活力,最适反应温度,最适反应ph,反应动力学等基本酶学性质lol.2枯草芽孢杆菌在农业中的应用由于枯草芽孢杆菌能够分泌大量的抗生素,能够杀灭一些动植物中常见的病源菌,而且其分泌大量酶对牲畜有益,所以枯草芽孢杆菌常用于农业中.2.1枯草芽孢杆菌在饲料中的应用纳豆枯草芽孢杆菌(bacillussublitisnatto)是枯草芽孢杆菌的一个亚种ll11,是我国农业部公布的12种可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂之一l.犊牛消化酶系统发育不健全,出生后蛋白酶系尚未建立完全,胃蛋白酶产生较晚,对固体物质和非乳物质的消化能力弱;免疫系统功能不完善,胃及肠对细菌的抵抗力很弱,抗

11、疾病的能力较差,外界环境不良时,易被大肠杆菌,沙门氏杆菌等病原菌侵袭,从而引起犊牛胃肠疾病,严重时甚至造成死亡.作为可直接饲用微生物,纳豆芽孢杆菌能在肠道内生长,分泌各种酶和维生素,促进小肠黏膜细胞的增殖,促进胃肠道各种消化酶活性,并具有抑制肠道内有害菌的作用.犊牛直接饲喂纳豆枯草芽孢杆菌对增强犊牛机体免疫和促进胃肠发育具有良好的效果13】.2.2枯草芽孢杆菌在生物农药中的应用2.2.1枯草芽孢杆菌在动物养殖中的作用枯草芽孢杆菌在水中大量繁殖时分泌的胞外酶可分解,吸收水及底泥中的蛋白质,淀粉,脂肪等有机物,有降低水体富营养化和清除底泥的作用.在作用过程中,有机营养一部分转化为细胞物质,大部分转

12、化为细菌活动的能量.在其转化过程中,氨气,氮气就从水中逸散到大气.用这种方法,水中氨氮和硝基氮可除去80%90%.另一部分有机营养转化为优势的有益菌体.此法广泛应用于河蟹育苗,虾类养殖以及河触,黄鳝,甲鱼养殖l4】.第9期李明等:枯草芽孢杆菌的研究与应用?113?2.2.2枯草芽孢杆菌在农作物病虫防治中的作用随着人们环保意识的加强,生物防治因其对环境,生态和人类健康安全的优点,受到各国政府的广泛重视,并发挥着越来越重要的作用.应用枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究具有悠久的历史,目前全世界收集保存了几百株野生型枯草芽孢杆菌菌株,研究证实该种革兰氏阳性细菌能够产生40多种具有不同结构的抗菌物质,其中

13、很多具有优良性状的菌株已经应用于生产实践,例如,美国的gbo3,mbi600,qst713和b.subtilisvar.amyloliquefaciensfzb24,澳大利亚开发的ubtilisa213,日本东京技术研究所的subtilisrb14,中国开发的b916,b908,b3,b903,xm16等il51.王益民将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌进行细胞融合获得了具有抑菌杀虫作用的融合子cf103,田间试验结果显示,cf103能兼治水稻纹枯病和稻纵卷叶螟,对照区病情指数为49.8%,虫害率为41.5%,而防治区分别为0%36.9%和1.7%12.1%.陈中义等构建了含有crylac基因的两

14、个穿梭表达质粒载体旧,导人生防枯草芽孢杆菌b916,获得了兼有杀虫防病效果的基因工程菌bs2014和bs2249,同时还将crylab,crylac,cryl2aa等杀虫基因导入b916并获得了一系列单价和双价杀虫防病工程菌181.3枯草芽孢杆菌在现代科学研究中的应用枯草芽孢杆菌除主要用于其自身酶系和抗生素外,也用于作为表达系统和细胞质融合的研究.3.1枯草芽孢杆菌表达系统的研究自1958年spizizen发现枯草杆菌168菌株能摄取外源基因以后ll91,随着dna重组技术的建立,特别是金黄色葡萄球菌(stophylococcltsaureus)带抗性标志的质粒可作为其载体的发现,枯草杆菌基因

15、工程研究迅速发展.芽孢杆菌作为原核表达系统与大肠杆菌表达系统有很大的区别,芽孢杆菌不能识别大肠杆菌的启动子,因此构建表达外源基因的枯草杆菌表达系统是研究者关注的问题.目前尚无商品化的枯草芽孢杆菌专用表达载体,为构建枯草芽孢杆菌的表达载体,获得枯草芽孢杆菌能够识别的启动子序列是首要条件.陈晓月等根据genbank中枯草芽孢杆菌的p43启动子基因序列,设计合成了一对引物,用pcr方法钓取枯草芽孢杆菌as.1655菌株的p43启动子基因,pcr产物经琼脂糖凝胶回收纯化后,连接到pmd18tsimple载体上,进行序列测定.测序结果表明,枯草芽孢杆菌as.1655菌株的启动子全长427bp,由两个叠加

16、的启动元件组成,分别为和卯rna聚合酶识别的位点,与genbank中的其他序列比较发现核苷酸的同源性为99.5%,说明枯草杆菌启动子的基因序列高度保守_圳.陈中义等分别以枯草芽孢杆菌一大肠杆菌穿梭质粒phb201和prp22为载体,通过感受态转化方法,将bthd21杀虫蛋白基因crylac导人了水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌b916.3.2枯草芽孢杆菌细胞质融合方面的研究早在1981年,复旦大学的江行娟等就发现,在peg存在下,枯草杆菌bd366(pub110)菌株和g1菌株的原生质体以1010的融合率发生融合.高温能使质粒pub110消除,质粒消除后融合子的菌落形态转变成为亲本gl的形态特征

17、.他们认为双亲细胞融合后没有发生遗传重组,而是在分裂过程中发生分离,于是质粒pub110可能出现在g1细胞中,他们的试验为通过细胞融合的质粒转移和由于某一特定质粒的存在而改变菌落形态提供了初步证据i221.上世纪90年代,唐文华等和刘伊强等将枯草芽孢杆菌与bt通过细胞融合获得了具有抑菌杀虫作用的融合子,从而使得该菌既有抗虫性又有抗药性,成为一种极有前景的农药制剂例.4枯草芽孢杆菌应用中存在的问题枯草芽孢杆菌的产业化应用尚不成熟.首先是在医药方面,我们尽管已经证明了枯草纤溶酶具有良好的溶血栓效果,但是在国内相应的商品化的药品却不多见.而且枯草脂肪酶用于制作相应的药物还不成熟,有待进一步研究.其次

18、,在农业方面一些相应的生物农药和饲料也没有得到大范围的应用.这主要是由于科技的不均衡性和理论转化为实际的考察期较长造成的.枯草芽孢杆菌自身有需要克服的问题.枯草芽孢杆菌虽然可以直接作用于农业来抗一些植物病虫害,然而,天然野生型微生物菌剂存在天生的不?l14?东北农业大学第40卷足,如产品持效期短,见效慢,作用对象比较单一,易受自然环境影响,竞争存活能力有限等251.尽管枯草芽孢杆菌已经作为表达系统并在试验中应用,但是其自身具有的多酶体系使得转入它的外源质粒不太稳定,从而使其作为表达系统有一定的困难.5展望尽管枯草芽孢杆菌在应用中存在一些问题,但是人们也在不断地研究克服其缺点的方法,例如陈乃用早

19、在1993年就详细地分析了枯草芽孢杆菌的质粒稳定性问题,并提出了一些相应的解决措施261,可以说枯草芽孢杆菌成为像大肠杆菌那样成熟的表达系统只是时间问题.同时枯草芽孢杆菌中的其他酶,如淀粉酶和蛋白酶也逐渐成为了人们关注的热点.这些都将会为枯草芽孢杆菌的应用开拓新的领域.随着科学技术的不断进步,那些限制枯草芽孢杆菌应用的问题将逐一被解决,而枯草芽孢杆菌也必将迎来一个更宽广的应用空间.参考文献【1】沈卫锋,牛宝龙,翁宏飚,等.枯草芽孢杆菌作为外源基因表达系统的研究进展fj.浙江农业,2005,l7(4):234238.2】sumh,hamadah,tsushimah,eta1.anovelfibr

20、inolyticenzyme(nattokinase)inthevegetablecheesenatto:atypicalandpopularoybeanfoodinthejapanesedietjj.experientia,1987,43(10):l11ol1l1.【3】刘柳,郭勇.层析法分离纳豆激酶的研究jj.现代食品科学与技术,2006,23(1):17-19.【41nakamurat,youhery,eijii.nucleotidesequenceofthesubtilisinnat,aprofbacillussubtilis(ntto)明.bioseibinteehbiochem,1

21、992,56(11):18691870.【5】王开敏.豆豉产纤溶酶菌株的分离,鉴定及其基因的真核表达研究dj.哈尔滨:东北林业大学,2007.6】陈哗,陈跃,张文光.枯草芽孢杆菌(bacillussubtiliszy-1)溶栓酶的分离纯化及其酶学性质【j.福建医科大学,2008,42(2):143一l46.7bejl,wangjw,wangxz,eta1.highexpressionoflip1inpichiapastorisj?actabiochimicaetbiophysicasinca,2003,35f4):366370.8erichj,thorstene.lipasesforbiote

22、chnologyj.currentopinioninbioteehnology,2002,13(4):390-397.【9】dartoisv,coppeejy,colsonc,eta1.geneticanalysisandover-expressionoflipolyticactivityinbacillussubtilis【j】.appliedandenvironmentalmicrobiology,1994,6o(5):1670-1673.10】马吉胜.枯草杆菌脂肪酶的基因克隆,定向进化与非水酶学研究【d.长春:吉林大学,2005.【11布坎南re,吉布斯ne.伯杰细菌学鉴定手册【m】.8版.北京:科学出版社,1984.【12胡东新,潘康成.微生态制剂及其作用机理fj】.中国饲料,2001f3):1416.13邓露芳,王加启,姜艳美,等.犊牛饲用纳豆枯草芽孢杆菌液体培养条件的优化饲料工业,2008,29(6):3738.14】仇丽.枯草芽孢杆菌在养殖中的应用fj】.渔业现代化,2002(4):2628.(15陈中义.多功能质粒