HPLC同时测定护肝片中5种成分的不确定度分析

1、HPLC同时测定护肝片中5种成分的不确定度分析【摘要】目的：建立 HPLC法测定护肝片中腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的不确定 度评定方法。方法：根据测量不确定度评定与表示的有 关规定，分析影响含量结果不确定度的因素来源，并对各不 确定度因素进行评定，计算合成不确定度，最终给出扩展不 确定度和报告不确定度。 结果：不确定度评估为腺苷 081%， 五味子醇甲 086%，五味子酯甲 067%，五味子甲素 074%， 五味子乙素 078%。结论：对照品的配制、样品溶液、进样 重复性的不确定度是肝片 5 种成分不确定度的主要来源。【关键词】HPLC;护肝片；腺苷；五味子醇甲；五味

2、子酯甲；五味子甲素；五味子乙素；不确定度【中图分类号】R2841【文献标志码】A【文章编号】1 007-85 1 7（ 20 1 6） 1 0-0033-04Abstract ： Objective To establish a HPLC method for uncertainty analysis of Adenosine 、 Schisandrin、 Schisantherin 、 Deoxyschizandrin and Schisandrin B in Hugan Tabelts. Methods According to the technical requirements of

3、Evaluation and expression of uncertainty in measurement ， each active component of uncertainty was calculated the variable parameters among the procedures. The combined uncertainty and extended uncertainty reported Uncertainty were finally obtained by synthesized the uncertainties of various compone

4、nt variables. Results The uncertainty for Adenosine was 081%， Schisandrin was086%， Schisantherin was 067%， Deoxyschizandrin was 074%and Schisandrin B was 078%. Conclusion The uncertainty of reference standard qualrity was the main source of five components measurement uncertainty in Hugan Tabelts.Ke

5、ywords：HPLC；Hugan Tabelts；Adenosine ；Schisandrin； Schisantherin ；Deoxyschizandrin；Schisandrin B； measurement uncertainty护肝片由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆 等六味中药经提取、加工制成的中成药，收载于 2010 年版 中国药典一部 1 ，具有疏肝理气，健脾消食，降低转氨 酶的功效，临床用于慢性肝炎及早期肝硬化等。测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性， 与测量结果相关联系的参数 2 ，它是被测量客观值在某一量 值范围内的一个评定，其大小决定了测量结果的实用

6、价值。 测量不确定度是评价定量方法的可靠性与测量结果的可信 程度的主要内容之一，其重要性已得到广泛认可。目前，测 量不确定度的评定在环境分析、食品检验、药物分析等领域得到深入的研究和广泛的应用 3-8 。研究根据测量不确定 度评定与表示（JJF1059-1999中有关规定，对护肝片中5种成分含量的测量不确定度进行分析，以找出影响不确定度 的因素，对不确定度进行评估，为评价检测报告提供理论依 据，以控制测量结果的有效性和适宜性。1 仪器与材料11 仪器 Agilent 1200 系列高效液相色谱仪（ Agilent 1200 LC色谱工作站、 G1322A DEGASSE溶齐脱气机、 G1311

7、A四 元泵、 G1329A 自动进样器、G1314B VWD 紫外检测器） ；CP225D电子天平（德国赛多利斯）；COBOS AW-120自动电子天平（西班牙）； SB3200WS 超声波清洗器 （上海必能信） ； Type HT-203A column HEATER（天津市恒奥科技发展有限公 司）。12 材料 腺苷（批号： 110879-200202）、五味子醇甲 （批 号：110857-201412 ）、五味子酯甲 （批号： 111529-200302 ）、 五味子甲素（批号： 0764-200107 ）和五味子乙素（批号： 110765-200407）对照品均购自中国药品生物制品检定所

8、。 护 肝片（批号： 20130512、 20141122 ，黑龙江葵花药业股份有 限公司； 批号：20140702，广东省惠州市中药厂有限公司） 。 乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试齐为分析纯。2 方法与结果21 色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （250 x 46 mm , 5卩m）;流动相：乙腈（A） 07%磷酸溶液（B）梯度洗 脱（见表1）;流速：08 ml/min ;检测波长：014min ,260nm ; 140158min , 250nm ;柱温：30 C；进样量：10卩l。理论 板数按腺苷计应不低于 2500。22 溶液的制备221 混合对照品溶液

9、的制备分别精密称取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品1469、1980、989、1112、1138 mg 置 25ml 量瓶，加 50%甲醇溶解 并定容至刻度，分别配制成对照品贮备溶液;各精密取 2ml 置 25ml 量瓶中，加 50%甲醇稀释并定容至刻度（含腺苷 00470mg/ml 、五味子醇甲 00634mg/ml 、五味子酯甲 00316mg/ml 、五味子甲素 00356mg/ml 、五味子乙素 00364mg/ml 的溶液）即得。221 供试品溶液的制备取本品 10 片，除去包衣后，精密称定，研细，取约 1 片的 量，精密称定，精密加入 50%甲醇20mL，

10、称定重量，超声 处理（功率250W，频率40KHz） 50min，放冷，用甲醇补足 减失的重量，摇匀，滤过，滤液用 045卩m微孔滤膜滤过， 取续滤液，即得。222 阴性对照溶液的制备按处方中药味的比例，分别自 配不含板蓝根和不含五味子的群药，按其工艺制成阴性对照 样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。23 方法学考察231 线性关系的考察精密称取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品适量，以50%甲醇为溶剂，配制成混合对照品溶液。倍比稀释法配置成系列质 量浓度的溶液。进样10卩I,测定各组分峰面积。以各组分 浓度（C）横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲

11、线，得回归方程。腺苷：A=38133 C+13918，r=09998 ;五味子醇甲：A=20180 C+11309, r=10000;五味子酯甲：A=14253 C+59979，=09999 ;五味子甲素：A=17825 C+38007，=10000 ； 五味子乙素： A=26780 C-15709， r=09999。232 精密度试验精密吸取同一供试品 （批号： 20130512）溶液10卩I,按上述色谱条件进样，测定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积，重复进样6 次，其 RSD分别为 085%、059%、105%、076%、081%。233 重复性试验取同一批样品

12、（批号： 20130512）约 1 片的量共 6 份,精密称定,分别制备供试品溶液,各进样 10 卩I，测定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，结果 RSD分别为：183%、139%、221%、 179%、 150%。234 稳定性试验取同一供试品 （批号： 20130512）溶液, 分别在0、1、2、4、6、& 10、12h时进样10卩I，记录色 谱峰面积,计算腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲 素和五味子乙素的峰面积的 RSD分别为152%、088%、191%、125%、 095%235 加样回收率试验精密量取已测定腺苷、 五味子醇甲、 五味子酯甲、 五味子甲素

13、和五味子乙素含量的护肝片 （批号： 20130512）样品 9 份（每份约 05 片的量），精密称定，每份 分别精密加入一定量的腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五 味子甲素和五味子乙素对照品， 制备供试品溶液， 进样测定， 计算加样回收率，结果平均回收率分别为9945%、 10010%、9919%、9969%、9988%。RSD分别为：159%、150%、178%、 171%、 150%。3 不确定度来源的识别及分析31 不确定度的来源从检测过程和数学模型分析， 样品中 5种成分含量的相对标准不确定度 ？Urel来源，主要包括： 对照品溶液浓度的相对标准不确定度 Urel（ Cs）；供试品溶 液

14、配制过程引入相对标准不确定度 Urel（V）；HPLC测定峰 面积相应值的相对标准不确定度 Urel（A）、Urel（As）。即：Urel=U2 rel （ Cs） + U2 rel （ V） + U2 rel （ As） + U2 rel （ A）32 对照品溶液浓度的相对标准不确定度Urel（ Cs）： Urel（Cs）的来源：对照片的纯度的不确定度；对照品的称量所产生的相对不确定度Urel （ms）;配制对照品溶液产生的相对不确定度 Urel（Vs）。321 对照品的纯度的不确定度对照品腺苷、 五味子醇甲、 五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均购自中国药品生物 制品检定所， 由于尚无法得

15、到不确定度参考值， 故此项忽略。322 对照品的称量所产生的相对不确定度Urel（ ms） 检定证书中1/10万天平称量允差为 OOlmg，按矩形分布计算不 确定度为 u（ms1）=001/3=00058mg ；该天平称量时重复性 标准偏差为 OOlmg，即u （ ms2） =001mg;腺苷、五味子醇 甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素5 种对照品的取样量分别为 1469， 198O， 989， 1112， 1138mg ，则对照品称 量所引起的相对标准不确定度为：腺苷： Urel（ ms 腺） =u（ms1 ） 2+u（ ms2） 2m=OOO582+OO121469=OO8%同理五味

16、子醇甲： Urel （ms醇）=006%;五味子酯甲： Urel （ ms 酯）=012%;五味子甲素：Urel （ ms 甲）=010%； 五味子乙素： Urel（ ms 乙） =010%。323 对照品溶液配制的相对不确定度对照品溶液配制过 程中分别使用了 25ml 量瓶与 2ml 移液管，其不确定度分别 如下：校准，A级25ml量瓶、2ml移液管的允许偏差分别 为土 003ml，土 001ml，按矩形分布计算不确定度为 003/3=00173ml，001/3=00058ml :重复性，用 A 级 25ml 量瓶与 2ml 移液管重复吸量蒸馏水 10 次，测得重复性不确 定度 u（ Vs2

17、5） =00034ml，u（ Vs2）=00010ml;温度，环 境温度为室温（20 5）C，溶剂水的体积膨胀系数为21 X10-4，按矩形分布，环境温度引入的不确定度为u( Ts25)=(5X 21 X 10-4X 25) /3=00152 C, u (Ts2) = (5X 21 X 10-4X 2) /3=00012 Co对照品溶液配制过程中分别使用了 25ml 量瓶 2 次， 2ml 移液管 1 次，因此对照品配制过程的引入的相对不确定度为：Urel( Vs25) =001732+000342+00152225=009%Urel( Vs2) =000582+000102+0001222=

18、030%Urel( Vs) =2X 000092+000302=033%因此， 对照品溶液浓度引入的相对不确定度分别为：腺苷：Urel (Cs腺)=000082+000332=034%;同理五味子醇甲：Urel(Cs醇)=034%; 五味子酯甲：Urel ( Cs酯)=035%；五味子甲素：Urel ( Cs 甲)=035%;五味子乙素：Urel ( Cs乙)=035%。33 供试品溶液配制过程中引入的相对标准不确定 Urel(V)供试品溶液在配制过程中使用了 20ml移液管，其不确 定度如下：校准，A级20ml移液管的允许偏差为土 003ml， 按矩形分布计算不确定度为003/3=00173

19、ml :重复性，用A 级 20ml 移液管重复吸量蒸馏水 10 次，测得重复性不确定 度u (Vs20) =00030ml;温度，环境温度为室温(20 5) C, 溶剂水的体积膨胀系数为 21 X 10-4，按矩形分布，环境温度 引入的不确定度为 u(Ts20) =(5X 21 X 10-4X 20)/3=00122 C。 则样品溶液配制过程中引入的相对不确定度为：Urel(V) =001732+000302+00122220=011%34HPLC测定峰面积相应值的相对标准不确定度Urel （A）,Urel （As） Urel （A）, Urel （As）主要由重复进样引起，由仪 器给出的进样

20、峰面积标准偏差为随机测量，属A类不确定度。混合对照品溶液重复进样 6 次，其峰面积的标准不确定度按 贝赛尔公式计算 S=E（ Ai-A） 2n-1，混合对照品中腺苷、五 味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相对标 准不确定度分别为 Urel （AS腺）=S腺A腺=059%, Urel （AS 醇）=s醇 A 醇=066%, Urel （AS酯）=S酯 A 酯=035%, Urel（AS 甲）=S 甲 A 甲=042%, Urel （AS 乙）=S 乙 A 乙=057%。同理,供试品中 5 种成份的相对不确定度分别为 Urel（ A 腺） =043%, Urel（ A 醇） =041%

21、, Urel（ A 酯） =044%, Urel（A 甲） =048%, Urel（ A 乙） =039%。35 计算合成不确定度将所有的不确定度分量进行汇总（表 2）,有利于更直观分析各分量的大小。 对 5 种成分进行 合成不确定度计算,结果分别为：Urel 腺=U2rel （CS腺）+U2rel （V） +U2rel （AS腺）+U2rel （A 腺）=000342+000112+000592+000432=081%同理：Urel 醇=086%, Urel 酯=067%, Urel 甲=074%, Urel 乙 =078%。根据样品测量方法得护肝片（批号： 20130512）中 5 种成分

22、的含量为 X腺=029mg/片，X醇=056mg/片，X酯=013mg/ 片，X甲=014mg/片，X乙=029mg/片。贝U 5种成分含量的相 对合成不确定度分别为mg/片，Ux醇=056 x 086%=00048mg/片，Ux 酯=013 x 067%=00009mg/ 片，Ux 甲=014 x 074%=00010mg/ 片，Ux 乙=029 x 078%=00023mg/ 片。36 计算扩展不确定度及测量结果取 95%的置信概率， 包含因子k=2,则U=2x Ux,本次实验所测量样品的含量及不 确定度见表 3。4 讨论 分析评估不确定度，应尽量注意产生不确定度的所有来 源，因为合成不确定度的数值取决于重要的不确定度分量。从表 2 各标准分量的不确定度可知，本研究测定护肝片中 5 种成分结果的各分量不确定度均较小，