固定化酶在医药领域的应用及发展展望

1、固定化酶在医药领域的应用及发展展望关键词：酶工程，酶的固定化，制药，应用一、酶工程概述酶工程是酶的生产与应用技术的过程，比如将酶、含酶细胞器或细 胞（微生物、动物、植物）等在一定的反应装置中，利用酶所具有的 生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用的物质。 它包 括酶制剂的制备，酶的固化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面的内 容。其应用主要集中于医药工业、食品工业及轻工业中。（一）酶的固定化技术酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。酶的化学本质是蛋白 质，其最大弱点是不稳定性，对酸、碱、热及有机溶液容易发生酶蛋 白的变性作用，

2、从而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中进行反应， 反应以后会残留在溶液系统中不易回收，造成最终产品生化分离提纯 操作上的麻烦。加之酶反应只能分批进行，难于连续化、自动化操作。 这大大地阻碍了酶工程的发展应用为克服上述缺点， 要将游离酶固定 化后进行应用。固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶， 用人工 方法固定在载体上。由于固定化酶的运动被化学或物理的方法限制 了，能将其从反应介质中回收，所以它原则上能在批量操作或连续操 作中重复使用酶。固定化酶技术是酶工程的核心，它使酶工程提高到一个新水平。1.1吸附法吸附法是通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将 酶吸附在炭、有机聚合物、玻璃、无

3、机盐、金属氧化物或硅胶等材料 上。该方法又分为物理吸附法和离子吸附法。此法简便，且酶变性的可能性较小。但是在酶和载体结合具有弱键的本质， 在使用过程中 易解吸，又由于载体具有非特异性吸附剂的本质， 因此可能同时吸附 除酶以外的其他物质。1.2包埋法将酶或酶菌体包埋在多孔载体中使酶固定化的方法 ，称为包埋法。 包埋法分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、 可获得较高的酶活力回收。包埋法专用的载体主要有：明胶、聚酰胺、 琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。包 埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋 法。凝胶包埋法是将酶或酶菌体包埋在各种凝

4、胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透 膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。1.3交联法交联法是借助双功能基团试剂使酶蛋白分子之间或微生物细胞之 间发生交联，聚合成网状结构，而制成固定化酶的方法。应用较多的载 体有戊二醛、己二胺,异氰酸盐,氨基硅烷等。本法在固定化酶中应用 较多,如美国诺伏实验室有限公司用戊二醛交联法已能大量生产固定化葡萄糖异构酶。1.4酶反应器的研制为了提高固定化颗粒的强度，改善固定化颗粒的传递特性，调节固 定化颗粒的比重，减少固定化过程中的活性损失，国内外酶学者进行 不懈地努力，近一、二十年代来有关这方面的报道大量涌现。由于生 物反应物

5、系理化性质复杂各异，迄今为止还没有一种通用的理想的反 应器。譬如搅拌反应器，由搅拌产生的较大的剪切力，常常会破坏固定 化细胞。气升式反应器中气泡容易凝并而造成气含率不足的现象，而填充床的传质系数和传热系数较低，容易产生给排气体不足的现象。 膜反应器成本高，而且当细胞浓度高时，常常会引起膜破裂，反应液需 预处理等等。总之，生物反应器的结构设计还不断地被改进以适应生 产工艺需要1。（二）固定化酶的新型制备方法2.1共价固定法酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子 表面远离活性位点的特定稀有基团（如巯基）进行反应，使该基团与载 体上另一基团共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液

6、方向， 以达到控制其空间取向的目的。Collioud 等化学合成一个异双功能试剂（N-m 3 一（trifluoromethyl）diazirin-3-ylphenyl 4 一maleimidobutyr amide），他们利用这种双功能试剂成功地实现了氨 基酸、合成肽和抗体Fab片段的定向固定。Stein等通过衍生全氟叠 氮基苯疏水交联共价固定一种脂链细胞蛋白，取得了一致的空间取向。固定后的蛋白质分子结合牢固、稳定性佳，不能被离子或非离子 去污剂清除2。2.2氨基酸置换法利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基 酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。Hua ng

7、等通过定点突变在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效 果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高2.3抗体耦联法大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分 子中很多可供偶联用的官能团可以通过赖氨酸的 -氨基或末端氨基、天冬氨酸的B -氨基、谷氨酸的丫 -氨基或末端羧基进行一般性的 偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定抗体酶 (abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保持了很好的催化 活性。抗

8、体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上的 氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键 结合实现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性 提高的同时免疫吸附活性也提高了 3倍。2.4生物素-亲和素亲合法生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(0 . 0001%)的中性小 分子辅酶。亲和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含 一个生物素结合位点（解离常数105mol/ L）。生物素与亲和素或相 应细菌中的链霉亲和素有高专一性的、 极强的亲和力。这种特性使其 成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、基因工程和蛋白质分离等 领域中独特有力的工具。将生物素羧

9、化载体蛋白、片段分别融合在荧 光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白定向固定在亲 和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了 8倍，固定化酶的稳定性和 固定效率均大大提高3。2.5疏水定向固定法细胞粘着分子（cell adhesion molecules ，CAMs是介导细胞-细 胞、细胞-底物粘着、细胞发育和细胞信号发生的分子。细胞粘着分 子和其它细胞表面分子通常通过疏水作用固定在脂质膜上，磷脂锚定是常选择的方式。接触位点A糖蛋白是调节发育的细胞粘着分子， 产 生于多细胞发生早期，通过形成高亲和、EDTA稳定的接触位点介导 细胞粘着。接触位点A糖蛋白可通过神经酰胺疏水同定在细胞表面。 疏

10、水定向固定可保持蛋白质分子结构、 生理活性及天然构象。这种通 过疏水作用的固定，固定的效率高，固定为非共价，而且固定过程可 逆，用去污剂可终止或消除同定应。Stein等用庚基胺修饰羧甲基葡 聚糖载体表面的羧基来疏水固定接触位点 A糖蛋白分子，成功地控制 了固定位点的空间取向。用 mAb7l特异结合来检测csA的活性状态， mAb71结合良好，而 mAb353则不能结合4。2.6微波/超声辅助固定化微波是一种电磁波，波长为0.1100 cm。微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而 摩擦生热，是从物质内部开始，瞬时达到需要的温度。微波加热具有 许多传统加热不

11、具备的优点，包括：加热迅速、均匀，不需要热传导 过程，内外同时加热，加热时间短；加热质量高，营养破坏少；节能 高效；易于控制功能等超声波是指振动频率大于 20 kHz以上的一种 纵波，在介质中传播时，使介质发生物理的和化学的变化，从而产生 一系列超声效应，包括热效应、机械效应、空化效应和化学效应。研 究认为，超声波对液体化学反应速度和产率的影响主要是超声波在液 体介质中的空化作用，超声可使液体介质中形成微泡，其破裂伴随能 量的释放，可以提高许多化学反应的速度。到目前为止，超声波技术 对物质提取，高分子降解，酶解反应等都有很好的促进作用。其中超 声波酶解反应具有高效、廉价、无污染，可提高酶促反应

12、速度和有效 成分的产率。二、固定化酶技术在医药领域的应用（一）改善溶液酶的应用缺陷酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应；是蛋白质，在体 内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏；稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜 中，可防止药物酶和蛋白水解酶以及其它免疫因子等直接接触，因而可延长酶在体内的半衰期和避免免疫过敏反应。如固定化的L-苯丙 氨酸可作为抗癌药物的载体将药物分子直接导入癌瘤区，其效果是其 他氨基酸的35倍。这样既可以抑制癌瘤生长，又可以降低药物的 毒副作用（二）通过“体外循环”做成人工脏器固定化

13、酶也可做成“人工脏器”参与体外循环，用于除去有害的毒 性物质及有潜在毒害作用的代谢产物； 除去氨基酸，使需要这些物质 的病变组织“饿死”；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固 定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再回流体内。如消血栓 和人工肾脏。A. 消血栓酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端， 酶在囊中不能漏出，小 分子物质能自由进出。B. 人工肾将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用 微胶囊固定化脲酶和活性炭组成人工肾。曲綁M、肮砥出I也龙彳匕孵祁 4*也咸卜申人工讶損我卿（三

14、）应用于疾病诊断用固定化酶来检测血糖，其中指示血糖浓度就是利用了固定化酶技 术。早期的血糖仪用 葡萄糖氧化酶比色法，试纸与血液反应后改变颜 色，到时间后抹去血滴再放入血糖仪通过测量色谱得到血糖值。 而现在通过测量血液中的葡萄糖与试纸中的葡萄糖氧化酶反应产生的电 流量测量血糖。市面上的主流机型大多为葡萄糖氧化酶测量法。其中试纸中的酶就是采用了固定化酶技术。（四）应用于生物制药行业现代酶工程具有技术先进、投资小、工艺简单、能耗量低、产品 收率高、效率高、效益大和污染小等优点，成为化学、医药工业应用 方面的主力军。以往采用化学合成、微生物发酵及生物材料提取等传 统技术生产的药品，皆可通过现代酶工程生

15、产，甚至可以获得传统技 术不可能得到的昂贵药品，如人胰岛素、 6-APA及7-ADCA等。固定 化基因工程菌、工程细胞以及固定化技术与连续生物反应器的巧妙结 合，将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本性变革。目前已有多种固定化酶用于大规模工业化生产，如：氨基酰化酶、 青霉素酰化酶、天门冬氨酸酶、天门冬氨酸-（3 -脱羧酶。1、氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以 用于生产各种L-氨基酸药物。1969年，日本田边制药公司将从米曲 霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用 DEAE葡聚糖凝胶为载体通过离 子键结合法制成固定化酶，将 L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用 来拆分DL-乙酰氨

16、基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸 经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游 离酶生产成本的60注右。2、青霉素酰化酶：这是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1973年已用于工业化生产，用于制造各种半 合成青霉素和头孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变 pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）或7-氨基头孢霉烷酸（7-ACA），也可以催化 6-APA 或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基 团的青霉素或头孢霉素。3、天门冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，

17、将具有 高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶， 用于工业化生产，将延胡索酸转化生产L-天门冬氨酸。1978年以后， 改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌 细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化 生产5。4、天门冬氨酸-(3 -脱羧酶：将含天门冬氨酸-(3 -脱羧酶的假单胞 菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸 -3 -脱羧酶，于1982 年用于工业化生产，催化L-天门冬氨酸脱去3 -羧基，生产L-丙氨酸。现在已经广泛试用酶工程制备生物代谢产物、转化甾体、抗生素 和维生素、生产氨基酸和有机酸、生产核苷酸类药物等。三、固定化酶

18、技术现状及未来在医药行业发展酶在生产生活中发挥了重要的作用，固定化技术作为酶工程的核 心有着不可限量的活力，固定化技术的出现使酶工业得以迅速发展。 在理论及实际应用上，酶固定化技术克服了游离酶的许多缺点 ，经 各国学者的不断的努力，固定化技术在各个领域取得了卓越的成效。我国固定化酶制剂应用到工业生产的实例却很少，因此固定化酶 的研究开发任重道远。国内外大量的研究证实，固定化酶技术目前还 存在固定效率低、载体的有毒性、成本高、稳定性差、不能大规模生 产等问题，这些都限制了固定化酶技术的发展与应用。 随着生物技术 及材料、化工等各相关学科的不断发展，固定化酶的工作会有新的突 破。将更多固定化酶取得工业化规模的应用，仍然是固定化技术领域 追求的目标。通过目前固定化酶技术在医药领域的应用，我相信固定化酶发展 的前景，尤其是在