真菌学实验报告

1、比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的 分析。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具， 真菌基因的多样性以及真菌分于生物学的发展，为生物技术产业提供 了一个广阔的天地。植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物 种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强 的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的 内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性 物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和 G+、G细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代 谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G

2、+、G-有普片遍的抑菌作 用。研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前 景。三.材料与方法：3.1.1材料：在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、 根、花、种于或果实。3丄2.药品与试剂：葡萄糖、蛋白淼、KH2P04 3H2()、MgSO4 - 7H2O, 马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白瞅 酵母 膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙 醇，().1%升汞(HgCl2)，次氯酸钠溶液(含活性氯10%), 30%双氧水。 双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、疏基乙醇(p- Mcrcaptoethanol),石英砂, Tris饱和酚，

3、氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐 酸，氢氧化钠，EDTA, CTABo3.1.3.培养基：3.1.3.1马铃薯、葡萄糖琼脂培养基马铃薯汁1000ml,葡萄糖20g,琼脂20g(注：取去皮马铃薯20()克，切成小块，加水10()()毫升煮 沸3()分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1()0()毫升，加葡 萄糖2()克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌3()分钟3.1.3.2察氏琼脂培养基蔗糖 30g, NaNO3 3g, MgSO4.7H2O 0.5g, KC10.5g,氏SO4.7H2O O.Olg, K2HPO4 lg,琼脂 13g,蒸憎水 1000ml,自然 pH3.1.3

4、.3沙氏培养墓蛋白淼lg,葡萄糖或麦芽糖4g,琼脂1.5克,水100 mlo 制法：1将上述物质称好，放入水中煮沸溶解(不必调PH 即有5左右)分中号试管(约4毫升)包扎，髙压115C20分钟。趁 热斜好，凝固备用。3.1.3.4马丁氏培养基葡萄糖 10g,蛋白5g, IH2PO4lg, MgSO4-7H2O 0.5g,1%孟加拉红3.3mL,琼脂2()g,水lOOOmL, pH值自然。抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素 4()U/tnL,青霉素30U/mL用量加入，冷却到45C左右未凝固时加入 抗生素，混匀倒平板。四方法：4.1.1采样方法：在校园内找到银杏、喜树、桂花树并用刀采

5、集叶、茎、 根、皮、种子。4.1.2样品前处理：分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用霰于取出，于 酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1 X lcn?大小置于PDA固体培 养基上。对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂(浸)洗2-3min无菌水冲洗4-6次-().1%升汞不同的 消毒时间(见表2-2,共设置7个梯度)一无菌水冲洗4-6次-用灭 菌滤纸吸干多余水分一无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧 皮部、木质部大致分开，并切成0.5X().5cn?大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。灭菌时,沥干的植物材料转放到

6、烧杯中，记好时间, 倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶 液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟，开 始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立 即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无 菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强 在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。4.1.3内生菌的分离方法：将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养 5块组织块）于27C恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗 组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。 观察菌丝生长情况及污染情况。4

7、丄4纯化方法：培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形 态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。纯化3-4次以保证 所得菌落为纯培养。4.2形态鉴定方法：4.2.1培养方法：4.2.1.1培养荃：査氏培养基、沙氏培养基和PDA培养基。4.2.1.2将4C保存菌种活化2次；4.2.1.3将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复4.2.1.425C恒温培养箱培养7天；421.5然后迸行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带于 粘片法），观察个体形态；4.2.1.6另两个平行继续培养至14天，取出；421.7重复步骤4,作为最终描述结果；4.2.1.8根据真菌分类鉴定手册和相关资料分

8、析确该菌的归属。422制片方法:胶带粘贴法:选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的 胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳 酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于 显微镜下观察产砲结构等特征。4.2.3鉴定标准：观察的要点：4.2.4菌落宏观形态：大小：以菌落的直径（mm）表示。颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或 疏松等。菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、 有无成束状或绳状的气生菌丝。菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。菌落边缘：全

9、缘、锯齿状、树枝状等。渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。4.2.5个体形态：菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等分生砲于梗：分支情况-简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光滑等。产孑包结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互 生或成轮生体）分生砲于的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成头）4.3分子生物学鉴定：4.3.1培养方法：培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。将液体培养基以lOOmL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口蒸汽灭菌20mino将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27C、120rpm培养5-

10、7天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸憾水冲洗菌丝球5 次，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。40C下烘干菌丝，但是不 要过于干燥，然后进行DNA的提取。4.3.2基因组DNA的提取DNA 提取采用 CT AB 法。CT AB (cetyltricthylammonium bromide,十六烷基三乙墓漠化钱)是一种去污剂，可溶解细胞膜， 它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度 到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复合物 同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解 于髙盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。C

11、TAE法 的好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到髙含量的DNA。43.2.1用CTAB法提取材料DNA的具体步骤如下：将CTAB buffer在65C水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；4.322取O.lg左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入 5mL预热的提取液及1()卩邛-疏基乙醇，混合均匀后把混合液转入 1.5mL离心管中7()()uL/管;4.323于65C水浴保温0.5-1 h,时间不能超过1.5h。保温期间要轻轻 振摇几次；4.324冷却至室温后，加入等体积(7()()pL)的饱和酚：氯仿:异戊醇(25: 24: 1),充分混匀后静置10mino4.325离心(12000r

12、pm, lOmin,室温)，去沉淀,将上清液转入干净离 心管中。4.326根据杂质的去除情况重复步骤4、5数次，直至无杂质；4.327加入等体积氯仿：异戊醇(24: 1)抽提一次以去除饱和酚，离心 (12()00rpm, lOmin,室温)；4.328将上清液逐滴加入两倍体积的-2()C预冷无水乙醇，以沉淀出DNAo室温放置10-20min,可以过夜；4.329挑取或离心去上清液(1000() rpm, 5min)的方法取出DNA;用75%乙醇洗涤两次； 37C保混箱中干燥后溶于适長的TE缓冲液中4C宙用。4.4所用引物1TS5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4: TCC

13、TCCGCTTATTGATATGC4.4.1PCR反应条件： 4.4.1.1体系：PCR反应体系为5()yL体系，包括:1/1010XPCR buffer：dNTPs (dATP、dTTIdCTP、dGTP):各 200yM,0.2piM,1 2.5U,约lOOngoPrimcrl()2pAI,Primcr2T叫酶：dna模板：4.4.2条件：扩增条件预变性95C5min变性95ClmAi复性51 Clmip延伸72Clmin延伸补齐72 ClOmin3035个循环4.4.3测序方法：送测序公司。4.4.4序例分析：五.结果及分析:纟吉果：试验分离到两种真菌5.1八爪金盘分离到菌种査氏正反照5

14、.1.1菌落宏观形态：大小：菌落的直径3.2 (mm)o颜色：包括菌落表面棕黑色背面灰色，色素渗入培养基。菌落表面的纹饰：如皱纹、整个菌落致密。菌落的质地：毡状菌落的高度：凸起或隆起。菌落边缘：锯齿状。渗出物：菌落表面无液滴。5.1.2个体形态：菌丝的特征：表面粗糙。分生砲于梗：分支复杂，轮生。5.1.3分于生物学鉴定通过PCR扩增和序列分析，送公司检测得到的序列为：TGAAGTTAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTGACCCCGGTCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGC

15、CTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTrCTGGCAT cgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatt cagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggtattccg gggggcatgcctgttcgagcgtcatttcaccactcaagcctcgcttggt attgggcatcgcggtccgccg

16、cgtgcctcaaatcgaccggctgggtct tctgtcccctaagcgttgtggaaactattcgctaaagggtgttcggga ggctacgccgtaaaacaaccccatttctaaggttgacctcggatcaggt agggatacccgctgaacttaagcatatcaaaatcggaggaa通过blast序列分析得到的结果为：Distribution of 100 Blast Hits on the Query SequenceSequences producing significant alignments:DewnptionMax Total

17、Quay E Max score scow cotr 归uo dartL-.1r-1 ”. r -”I-:-1 :,$ 1厂：.：;-飞IUXIracCUCocwutn !RniiK$im*久”-：RX、ir-m:；广in us rRTUCNnRiCArti) SSrRHA nmn 2RR rHUA nmo iturlan ninh R? nrgomw FT4A :am 的 rterr:msltanscnMilsDdOSf 1 HTSI) ndntFmlhdnsa1u10%r:ad fur;uM droa Al22 1 A?fiTUQsnc pjifliil sccuc* irternzi t

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20、Hw%5珈mU7 画51Uncultured fungus clone L046937-122-075-C01-unis 18S ribosomal RNA gene, partial sequenee; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and Internal transcribed spacer 2, complete sequenee; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequenceGenBank JF289117 1FASTA Graphics Po 於凶LOCUS

21、DEFINITICKJF2S9117 Uncultured gener partial riboscMl RNA602 bp DMA linear ENV 02-MOV-2011 L046937222-?5-372 18S zibosoMl RNA internal transcrib-d spacer 1, 583 internal transcribed spacer 2. conipleeACCESSION VERSION KEYKORDS SOURCEscqnicncc; and JFZ89117 JF289117.1unculcuxelfungus clone sequence; g

22、ene, and 285 ribcsomal 2IA gene/ r-arrial seqcncuGI：35472O374CR 9Ai：I5IFrohlich-Howox31c*r J , Bur raws r S.M. r Xier 2 , EnglmgrG. r Soloroan, P. A. z FraserrH. P, Ma3*ol-BraeerorO.L, Artaxar P. r BcgercwzD,ConradzRAndreoe/K.O./ Despresrv.R. nd PoschlrU.TITLEJOURNAL REFZREKCEAUIHCRSTITLE3iogecarapn

23、y m me air: rungal diversity over land and oceans Biogeosci Discuss er 7071-7096 (2011)2 (bases 1 co 602)Frohlich-Howoisky, J,OespresR and PoachlU Direct SubdssiznfunaiisJOURNAL Sxibmitted |01-FB-2011) Biogeachemist:ry/ Max Planok Institute forChemistryr Coh-Jcachin-EEchez-NmQ 27, Mainz 55123r GermanyFEATURESsourceLocacion/Qualiriers1602/oraanisn；=,uncultured fungus11/nci_C7pe=Mgencmio dna”/iaola*icn 3ourcc-wQir filter enple/dh_xref=ntaxon:175245n/clone=nL046937-122-075-C01-unisn/environiLencal_sampienisc R