可用来交论文生命科学进展综述——反义RNA技术与RNA干扰技术

1、反义 RNA技术与 RNA干扰技术摘要：RNA 是生物体内最重要的物质基础之一 , 它与DNA 和蛋白质一起构成了生命的框架。 因其能干涉哺乳 动物基因表达而颇受瞩目 , 并且由此而引发的 RNA 干涉( RNAi) 成为了当前分子生物学和细胞生物学最为热 门的话题之一。 RNA干扰技术在 2002年被Science 杂志评为年度十大科技成就之首，而反义RNA 技术的发现对现代医疗技术的发展也起着重要的作用 .常规的反义 RNA 技术是设计出与靶 RNA 互补的寡核苷酸 , 通过它 与靶 RNA 结合来干扰转录或翻译过程 ,使蛋白质不能被表达出来。本文通过对热点的RNA干扰技术以及反义RNA技

2、术的生物学特性，分子机制，产生方法，和应用以及展望等方面的介绍，在对比中得出该两种技术的 异同点，从而使对以 RNA干扰和反义 RNA为代表的 RNA技术有更深入的了解。关键词： 反义RNA技术， RNA干扰技术，生物学特性，分子机制，产生方法，应用, 展望Antisence RNA Technique and RNAi TechniqueAbstract ：RNA is one of the most essential fundamental substances, together with DNA and protein; it forms the frame of life. RNA

3、 has been much fixed eye on by the reason that it can interfere in the gene expression of mammals, which leads the RNAi to be one of the most heated topics in molecular biology and cytobiolog. With the RNAi technique regarded the first of the top 10 science and technology achievements by Science, th

4、e discovery of antisence RNA technique plays an irreplaceable role in the development of medical techniques. The regular antisence RNA technique designs the oligonucleotide which causes a complementation with the target RNA, by its combination with target RNA, it interferes the translation of transc

5、ription and translation, thus making it incapable for protein to express. This article introduces the biological characteristics, molecule mechanisms, preparation, application and future of both the antisence RNA technique and RNAi technique. With the contradistinction of these two techniques, we ca

6、n get a better and comprehensive understanding of them.Key word: antisence RNA technique; RNAi technique; biological characteristics; molecule mechanisms; preparation; application; future1概念1 1 反义 RNA技术：反义 RNA( antisence RNA)是一种与特异的 mRNA互补的 RNA分子，它通过配对碱基间 氢键作用于对相应的 RNA而形成双键复合物(即反义 RNA： mRNA二聚合体) ，抑制

7、 RNA的翻 译过程。而反义 RNA技术是指， 利用人工合成或生物体合成特定互补RNA片段或其化学修饰产物来抑制或封闭基因表达的技术。12 RNA干扰技术：RNA干扰( RNAinference, RNAi)是指双链 RNA( dsRNA)在细胞内特异性的诱导与之同 源互补的 mRNA降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象。2机理21 反义 RNA抑制基因表达机理无论是真核细胞还是原核细胞， 均含有反义 RNA。许多实验证明 , 病毒和细菌中反义 RNA 的调节或抑制基因活性是普遍存在的。 迄今在原核生物中发现的反义 RNA共11种，其中 9种作 用在翻译水平， 1种在转

8、录水平， 1种在复制前水平。 1 而真核生物中也发现有自然存在的反 义RNA, 并有将人工构建的反义 RNA注入细胞进行基因调控成功的报道。 例如 , 向脊椎动物细 胞内输入肌动蛋白的反义 RNA表达质粒 , 可以明显抑制肌动蛋白基因的表达 , 进而使细胞形 态发生改变。 又如 , 1990年国内报道 , 反义 C一Ha一 ras 寡聚核等酸可以干扰 C一Ha一ras 癌 基因的表达 , 抑制 P21蛋白合成等。反义 RNA 被认为是一种基因表达的抑制因子。 它在复制水平、 转录水平和翻译水平上都 能对相关基因的表达进行调控 2 ，其作用方式主要表现在以下几个方面 : 21 1 在DNA复制水

9、平的调控ColE1 等其他有关质粒复制的前提条件是合成适当的RNA 引物 (RNAII) , 它可以折叠形成一定的构象 , 与模板 DNA 恰当地结合。而反义 RNA(RNAI) 在一些蛋白质分子作用下 , 与 RNAII 及其前体配对 , 不但阻止了 RNAII与DNA 模板间的变性 , 而且还抑制了 RNaseH 对RNAII 前体的加工 , 因此无法产生合适的引物 , 使 ColE1 的复制受到抑制。21 2 在转录水平的调控Okamoto 和Freundlich 认为, tic RNA 结合于 crp mR2NA的 5端,这种分子间形成的 结构,类似于 RNA 聚合酶识别的转录终止信号

10、的二级结构。 在此,反义RNA 的作用方式与衰减 子的作用方式相似 , 以反式作用对转录过程本身进行调控。21 3 在翻译水平上的调控mic F、sar 及IS10 的反义 RNA 可以结合于靶 mRN的A SD 序列及编码区 ,从而抑制核糖体 与mRNA的 结合 , 直接参与翻译水平的调控。近来 ,Malmgren 等的研究结果也显示 , 在质粒 R1 中, 虽然反义 RNA、CopA 并不能与 repAmRNA在 SD 序列完全配对 , 但二者之间同样能形成吻触 复合体 (kissing complex) , 阻止核糖体在此处的结合 。另一方面 , Krink 和 Wulff (1987)

11、 通过研究 oop RNA 对cII 基因的调控推测 , 反义RNA 与靶 RNA 互补区段结合 , 形成RNA: RNA 双链结构 ,RNaseIII 可以特异性地对其识别 , 并将二者剪切掉 , 这种间接调控影响了翻译的 进行。22 RNAi的生物学特性和作用特点221 RNAi具有以下几个重要的生物学特性 : RNAi是 SiRNA介导的转录后水平的基因沉默 , 目前认为它对染色体 DNA的复制和转录过程 没有影响。 高度特异性 : RNA 只引起与 dsRNA 同源的 mRNA降 解 , 并不影响其他基因 mRNA的 表达 4 。 高效性 : 相对少量的 dsRNA就能有效抑制靶基因的

12、表达 , 这表明 dsRNA介导的 RNAi是以催 化放大的方式进行的 , 因此 dsRNA的抑制作用要比反义 RNA的抑制作用高出上十倍。 种属时效性 : RNAi 效应在低等生物中可以持续存在 , 但在哺乳动物细胞中只能维持一段 时间,一般在注入 dsRNA后的2 3 h 作用最明显 ,持续2 3 d 。 传播性和遗传性 : RNAi 效应可以突破细胞界限 , 在不同细胞甚至生物体间长距离传递 , 并且可以传递给子代 5 - 7 。222 RNAi与转录后水平的基因沉默 ( PTGS) 、共抑制 ( cossupp ression) 、基因压制( quelling) 的关系。上述几个概念之

13、间有着密切的关系：PTGS是指内源性基因在 “异常 RNA”( aberrant RNA)的诱导下发生基因沉默的调控过程。 被抑制的基因能够正常转录 , 但转录后的 mRNA产 物会被迅速的降解掉而无法积累和发挥功 能, 所以属于转录后水平的基因沉默机制。共抑制是指内源性基因在转基因或病毒感染的诱导下发生的基因沉默现象 , 大部分是转 录后水平的基因沉默 , 但在一些植物中转基因诱导基因功能的抑制涉及基因特异性甲基化过 程, 所以它也可以是转录水平的基因沉默。基因压制是指存在于真菌中由转基因诱导的抑制转基因自身和相应内源基因表达的转 录后水平基因沉默现象 5 。经过多年的研究 , 目前人们普遍

14、认为 RNAi、PTGS、cossuppression 、 quelling 都属于转 录后水平的基因沉默过程 , 并且可能具有相同的分子机制。223 RNAi的分子机制迄今关于 RNAi的分子机制主要有两种理论。其一是“随机降解 PCR 模式” , 其二是“核酸内切酶的切割模式” 8 。随机降解 PCR模式是以 SiRNA作为引物 , 让它与互补的靶 mRNA相结合 , 在 RNA依赖的 RNA多 聚酶 (RdRp ) 作用下 , 以靶 mRN为A 模板合成 1个cRNA与靶 mRNA杂合的双链 RNA,然后这个 cRNA /mRNA双链RNA被Dicer 酶降解 ,导致靶 mRN的A降解

15、, 同时又可以产生新的 SiRNA。核酸内切酶的 切割模式则认为长序列的 dsRNA导入细胞后 , 被剪切成长度约 2125个核苷酸的双链小分子 RNA片段( SiRNA) , SiRNA 作为引导 RNA ( gRNA)与蛋白复合物相结合 ,形成一种 RNA诱导的基 因沉默复合体 (R ISC) 。在ATP的参与下 ,活化的 R ISC识别与 SiRNA具有同源互补序列的靶 RNA, 对其进行切割 , 产生 RNAi效应 9-10 。22 4 非特异性干涉现象科研人员在对哺乳动物 RNAi的研究中发现转染的长链 dsRNA超过30 nt 就会引起非特异 性的蛋白质合成抑制和 mRNA降解,

16、而并不是人们所希望得到的特异性基因表达抑制。这种非 特异性抑制过程是宿主细胞对于应激或病毒感染的一种防御性反应 , 即干扰素反应。其原因 可涉及两个方面 ,其一是长链 dsRNA激活dsRNA依赖性蛋白激酶 PKR,活化的 PKR可以使翻译起 始因子 e IF2 的小亚基磷酸化失活 , 从而全面阻断蛋白质的翻译过程。其二是PKR被 dsR2NA激活后 ,还可以使 2, 5 多聚腺苷酸磷酸化 ,从而激活非特异性的 RNasel, 降解RNA 5,11 。3获得的制备方法以及实验方法31 反义 RNA制备 31 1 利用诱导剂诱导合成既然原核真核生物中均存在反义 RNA, 说明生物体存在有指导反义

17、 RNA合成的基因 , 可 通过寻找适当诱导剂使该基因开放、激活 , 从而获得相应的反义 RNA。31 2 采用重组 DNA技术构建反义表达载体首先分离相应的 mRNA, 以mRNA为模板合成互补 DNA, 再以该 DNA链为模板合成有意义 DNA 链, 形成双链 DNA分子, 将双链 DNA分子反向拼接于质粒中形成反义表达载体, 转录时表达载体将合成反义 RNA。图1：反义 RNA表达载体的构建Fig.1: The Construction of the Expression Carrier of Antisence RNA313 利用 Q复制酶技术扩增利用Q噬菌体的变体 MDV-（I 具有

18、 RNA复制酶的识别和起始序列） 作为载体 , 用RNase T, 将其 63位（ G）和64位（ U）之间切开 , 插入外源 RNA片段组成重组 RNA分子 , 若将MDV-I的CDDA 与质粒 PBR322组成重组体可以在体外扩增任一长度的RNA分子。该技术可以在体外高效地拷贝RNA分子序列。步骤为先分离 mRNA以此作为 Q复制酶的模板 , 由 Q复制酶催化合成互补 单链产物 micRNA，在产物链合成后 , 模板桩和产物链都能从复制复合物中释放出来 , 两者又 均可游离作为下一轮合成时的模板。如此往复, RNA可呈指数相扩增。31 4 体外化学合成化学合成反义 RNA 其优点总可以随意

19、设计序列 , 但价格比较昂贵 , 一般只适用于合成 比较小的 RNA分子32 RNAi的实验步骤321 SiRNA的设计首先检索感兴趣的核苷酸序列 , 并了解各个片段的功能。 通常在起始密码子下游 50100 nt以后寻找 AA （N19） TT或AA （N21）序列作为潜在的 SiRNA靶位点。 G/C含量在35% 50%之间 为最佳 ,应该避免选取高 G含量或连续的 G区段。在 EST文库或特定组织内的 mRN序A列中 ,用 BLAST检索所选序列的同源性 , 确保该 SiRNA只针对靶基因。对所选序列进行二级结构分析,去除有复杂结构的序列。另外选取一些与序列无关的SiRNA作为对照以排除

20、非特异性影响 ,通常是将选中的 SiRNA序列打乱后重新排列 , 同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源 性。一般我们针对靶向基因先设计 3 4对SiRNA,再筛选出最有效的 SiRNA6, 12 。322 SiRNA的制备目前主要有 5种 SiRNA的制备方法。化学合成法 :直接通过化学方法 ,以核苷酸单体为原料合成 2条互补的长 2123 bp的RNA单链 ,然后退 火形成双链 SiRNA复合体。 该方法主要用于将已经找到最有效的 SiR2NA进行大量合成 13 - 14。体外转录法 :设计针对靶序列的正义链和反义链 ,分别在其上游接上 T7启动子 ,进行体外转录获得单链 RNA,杂交后

21、形成 dsRNA,然后在体外用 RNA酶消化 , 从而获得 SiRNA。该方法适用于 SiRNA有 效片段的快速筛选 15 - 16 。RNase III 家族体外消化法 :将200 1 000 bp 的靶mRN作A为模板 , 用体外转录的方法制备针对此序列的长片段双链 dsRNA,然后用 RNase III(orDicer) 在体外消化 , 得到各种不同的 SiRNA混合物。该方法的 主要优点是跳过了检测和筛选有效SiRNA序列的步骤 , 适用于快速研究某个基因的功能 17- 19。SiRNA表达载体法 :通过转染含有 RNA聚合酶 III 启动子 U6或 H1,及其下游一小段特殊结构的质粒

22、或病毒载体 到宿主细胞内 ,转录出短发夹 RNA ( shRNA) , shRNA在胞内被 Dicer 酶剪成 SiRNA而发挥作 用。该方法主要适用于长时间基因功能的研究 20-22 。SiRNA表达框架法 ( SECs) :利用引物延伸法进行 PCR,产生包含 1 个RNA 聚合酶III 启动子 U6 或H1、一小段编码 shRNA 的 DNA模板和 1个RNA聚合酶 III 终止位点的表达框架 , 然后直接转染到细胞内表达 shRNA而 发挥作用。该方法是筛选 SiRNA最有效的工具 23 - 24 。323 RNAi作用的检测RNA干扰效果的检测方法是多种多样的 , 如: 检测转染细胞

23、上清液或动物血清中靶基因表 达产物可以用 Western blot 和EL ISA 方法; 检测转染细胞和组织中靶基因表达水平可以用免 疫组织化学方法 ; 检测靶基因 mRNA水平可以用 Northern blot 、斑点杂交技术及 RT - PCR方法 ; 检测靶基因 DNA水平可以用 Southern blot 、斑点杂交技术及 PCR荧光定量分析方法等等。 32 4 应用领域 相同领域： 在以下的相关领域中 RNA干扰技术以及反义 RNA技术都有着不同程度的应用以及巨大的发展 前景。 研究基因的基本功能： 反义 RNA技术：由于反义 RNA能高度特异地与相应 mRNA结合抑制特定基因的表

24、达 , 因此 , 在不需分离鉴 定基因产物的情况下 , 揭示该基因的功能 , 这远比通过突变体认识人类基因优越 , 因在人类 有些基因的突变体往往是隐性或致死的 , 从而弥补了经典遗传学在研究脊推动物方面的缺 陷, 并能使突变机制解祈更容易。RNA干扰技术 由于RNAi具有高度的序列专一性 ,可以诱导靶 mRN降A解,导致转录后基因沉默 , 抑制特异 性蛋白表达 , 引起细胞表型改变。 因此它被视为功能基因组学领域有力的研究工具。 目前 RNAi 技术已经成功的在低等生物中进行了大规模、 高通量基因水平的研究。 随着人类基因组测序 的完成 , RNAi 技术在人类基因组计划的后功能基因组研究中

25、将发挥更重要的作用27-28 。 遗传疾病方面反义 RNA技术：随着料学的发展 , 人们逐渐认识到越来越多的疾病与遗传有关。 遗传病在很大程度上是 体内遗传物质基因发生改变 , 成为致病基因在体内表达而引起的。 目前一般认为对遗传病尚 无真正根治办法 , 反义 RNA技术被认为是目前最具吸引力的手段之一, 人们只需分离出致病基因的转录产物 mRNA, 合成反义 RNA, 转入细胞内即可抑制致病基因的表达 , 从而达到治疗 多拷贝基因遗传病的目的。RNA干扰技术RNAi通过设计序列特异性的 SiRNA,封闭与某种疾病相关的基因 , 有可能治疗与此种已知 DNA序列基因相关的疾病 , 特别是单基因

26、遗传病 , 如多聚谷氨酰胺神经退行性病、脊髓延髓肌 肉萎缩症 ( SBMA)等等8 ，25 。 抗癌抗肿瘤 反义 RNA技术 在肿癌分子生物学的研究中发现， 几乎所有人类恶性肿瘤中都发现了激活的癌基因 , 提 示原癌基因的异常表达或其突变体的表达是致癌的关键之一。 怎样才能使癌基因失活而又不 使正常的原癌基因失活呢？采用反义RNA技术可以做到这一点。我们可以从癌组织中分离出mRNA从, 而合成相应的反义 RNA, 并将后者引入癌细胞阻止癌基因的表达 , 抑制癌蛋白的产 生, 从而达到控制恶性生长的目的。前叙用 C一Ha一ras 寡聚核苷酸干扰 C一Ha一 ras mRNA 的翻译就是一个成功的

27、例子。RNA干扰技术 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤共同作用的结果, 它的发生发展机制与原癌基因的激活、抑癌基因或凋亡相关基因的失活密切相关。 针对性的选择在癌变过程中发挥重要作用的 原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子及关键酶, 通过 PTGS进行封闭结合从而达到治疗肿瘤的目的 , 是肿瘤基因治疗的一个重要研究方向。 RNAi技术因其具有高度特异性、高 效性及低毒性等特点已经成为治疗肿瘤的新思路。 目前的研究已经包含肿瘤的发生发展、 侵 袭转移、 信号传导、 细胞周期调控、 凋亡及治疗等多个方面 , 涉及到的肿瘤相关基因靶点包 括KLF4, bcl - 2, bcr - abl, Tr

28、p - 53, k - ras, ErbB1, VEGF,MDR1, c - myc等等 28-30 。 抗病毒 反义 RNA技术反义 RNA针对目标基因特异性强 , 副作用小 , 很适合用于治疗目的。尤其容易用于治疗 病毒感染疾病 , 因病毒核苷酸的序列比较明确 , 易于人工合成相应的反义寡聚核苷酸抑制 病毒基因在宿主细胞内的表达 , 起到抑制病毒繁殖的目的。 据报道 , 采用这一技术抑制流感 病毒、疱疹、病毒、 AIDS病毒的体外实验已获成功。RNA干扰技术 病毒性疾病是一类传染性强、危害大的疾病。由于病毒是非细胞型微生物 , 必须进入宿 主细胞内才能复制 , 所以特异性抑制病毒在宿主细胞

29、内复制是控制病毒感染和传播的关键。 目前研究的焦点主要集中在对人类有较大威胁的肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒上。 有研究表 明病毒 mRN对A SiRNA介导的基因沉默是高度易感的 , 这提示通过用 SiRNA的序列特异性干扰作 用来封闭病毒基因在宿主细胞内复制将成为成为治疗病毒性疾病的重要手段 27 。 不同领域： 胚胎干细胞 （RNAi 在胚胎干细胞研究中的作用 ）: 因为 RNAi 技术能特异、 高效的抑制特定基因的功能 , 所以它被用于研究胚胎发育、 胚胎 干细胞分化及制备转基因动物等多个方面。有研究人员报道RNAi 对胚胎发育、干细胞的增殖分化有着巨大的影响 ,这表明 RNAi 将成为干

30、细胞研究领域中的重要工具 25 ，31 。4问题和展望41 反义 RNA技术 从对反义 RNA 的深入研究了解到 , 此类分子所参与的 RNA/ RNA 相互作用方式 , 赋予了反义 RNA 技术多方面的优越性 : 2 反义RNA 所介导的基因表达阻抑效应是特异的 , 其调控对象是有选择性的 ; 低丰度的反义 RNA , 同样可以产生高效的阻抑作用 ; 反义RNA 不能翻译产生蛋白质 ,因此反义 RNA 技术在基因工程上的应用具有很大的安全 性; 技术操作简单易行 , 适用范围广泛。但是，尽管应用前景广阔 , 但还有不少的具体问题有待于解决，有下：4.1.1 如何大量、便宜地制备反义 RNA和

31、提高其使用效率。目前已有资料表明反义 RNA：mRN二A 聚体在动力学上有瓦解的倾向 , 因此需给予比 mRNA 过量的反义 RNA, 看来采用重组 DNA技术构建反义表达载体和利用 Q复制酶技术扩增反义 RNA是一个很有价值的研究方向。 另一方面注重提高反义 RNA的使用效率 , 重点在增强其抗酶 解的能力 , 现一般采用对反义 RNA进行化学修辞的方法 , 也可考虑将反义 RNA与roboyxyme 结 合, 促进双链 RNA分子中 mRN的A 水解 , 从而提高反义 RNA的使用效率。例如，利用反义 RNA 能对基因表达进行调控的特点 ,设计出一段与靶 RNA 互补的 RNA 片 段,

32、使其与靶 RNA 碱基配对 , 以抑制与疾病发生直接相关的基因的表达 , 达到治疗疾病的目 的32,33 。反义 RNA 在封闭基因表达时 , 具有特异性强、操作简单等特点 ,可用来治疗由基因 突变或过度表达导致的疾病及严重感染性疾病。 不过, 如何得到与靶 RNA互补的反义 RNA 是个 很关键的问题 , 同时也需要很高的费用。那么怎样对反义 RNA 技术进行改进 , 使它更为便利、 费用更为低廉呢 ? 2002 年 ,Childs 等人发明了一种新型的反义 RNA 技术 RNA 错折叠 34。该技术中所使用的反义 RNA 比常规反义技术中所使用的 RNA 要短的多 ,只需8 12 个核 苷

33、酸就能破坏一个长达 400 个核苷酸的 RNA 分子。这对于代价昂贵的反义技术来说 , 不仅节 省了一大笔费用 , 引起的副作用也比较小。反义RNA 技术成功地抑制了疱疹病毒、 流感病毒、 HIV、肉瘤病毒等对组织细胞地侵袭 而寡核苷酸导向的 RNA 错折叠技术开辟了反义 RNA 技术发展的新方向。 虽然 RNA 错折叠技术 目前还不是很成熟 ,仍处于基础研究阶段 ,在不久的将来 ,RNA 错折叠技术有望成为治疗肿 瘤、病毒、细菌传染性疾病等的重要手段之一34 。除了医学等相关领域， 反义RNA 技术因为操作简单 , 准确高效 ,受到植物基因工程研究工 作者的普遍关注。 在植物基因功能及植物生

34、理代谢途径， 植物基因工程， 比如果实性状上的 控制， 植物抗病性研究， 改变油料作物种子脂肪酸含量， 以及植物雄性不育及其育性恢复研 究中的应用等方面都取得了较大进展， 同时目前正在进行的具有巨大开发前景的研究项目还有: 利用反义 RNA 技术改变花卉颜色 , 调控植物淀粉合成途径 , 增加植物对除草剂的抗性 , 转 基因植物中标记基因及选择标记的封闭, 改变植物中淀粉的含量等许多方面4.1.2 如何使反义片段容易地、完整地进入细胞。4.1.3 如何解决好反义片段的特异性问题。反义RNA应只与特异的 mRN结A合 , 而不应该与其它的 mRN结A 合。一般说来在一定的范围内 , 反义片段越长

35、特异性越高 , 但过长的 RNA自身局 部形成双链区、 影响反义 RNA：mRNA二聚体的形成。 目前已发现反义 RNA不需与 mRN等A 长 , 究 竟多长为适 , 值得研究。综上所述 , 反义 RNA作为一种新的生物工程技术已向人有展示了广阔的应用价值, 随着科学的不断发展 , 反义技术可望为生命科学带来一场革命。4.2 RNA 干扰技术 近年来,随着RNAi分子机制的进一步阐明 , RNAi 技术的发展有着日新月异的变化。但迄 今为止 , RNAi作为一种新兴的沉默特异基因序列的方法仍然面临着许多严峻的挑战。例如为什么作用于靶 mRNA上不同位点的 SiRNA具有不同的 RNAi效率 ?

36、 如何将 SiRNA安全导入细胞并 在细胞内稳定表达 ? 肿瘤细胞是否会对 RNAi介导的序列特异性 mRNA降解产生抵抗性 ? 对上 述问题的深入探讨将会大大推进人类基因组计划的研究进程 , 也将会为病毒性疾病、遗传性 疾病、恶性肿瘤等疾病的根治开辟新的途径，在研究功能基因组，发育生物学以及核移植， 基因治疗等相关领域有崭新而诱人的前景。比如：4.2.1 研究功能基因组虽然 RNAi 的作用机制还有很多未搞清楚 , 但是有很多的分子生物学家认为 RNAi 是研究 功能基因组的一个非常有用的工具。因为 RNAi 已被用来研究并搞清楚了包括果蝇、线虫和 一些植物的基因的功能。通过向线虫体内注射

37、dsR2NA , 给线虫饲喂能表达 dsRNA 的细菌 , 甚 至是把线虫浸泡在含有 dsRNA 溶液中来研究 RNAi , 都可以高效而方便地找出突变表型。 最近研究者甚至找到了更便利的方法 , 即通过增强内源的 RNA 发夹状结构的表达 , 诱导稳定 的具有序列特异性的的沉默现象 36 从而可以建立持续缺失某种功能表型的细胞系 , 为生化分 析提供大量的沉默细胞 , 同时 , 对某种表型进行长时间的观察评价也成为可能。预计不久的将来, 很多类型的培养细胞都能生长在“ RNAi 芯片” siRNA 的点阵的上面 , 可以记录基 因组中每个基因被抑制表达以后的表型 ,以及多个基因被渐次抑制后的

38、综合表型 , 从而可以 知晓基因的功能及他们之间的相互作用。 总之 ,RNAi 将在后基因组时代为解决疾病机理和鉴 定候选药物靶向的关键问题基因功能鉴定中发挥其简捷高效的特点而为人类服务。4.2.2 基因治疗RNAi 的靶位识别是一个有着高度序列特异性的过程。由siRNA 到靶链 , 互补的靶位识别具有专一性 ,3 端突出中的倒数第二个核苷酸影响靶mRNA的 裂解 , 一旦错配 , 将会使 RNAi的作用降低 24 倍, 指导性 siRNA 的5端和 3相对而言 , 对错配也有一定的允许性 , 但是 与靶 RNA 的断裂位点相对的 siRNA 中央的核苷酸是决定特异性非常重要的因素 , 即便有

39、一个 核苷酸改变 , 实验过程中就不能检测到 RNAi 现象37 , 说明siRNA 双链能够辨别基因靶位时的 突变或多态性等位基因 (polymorphic alleles) , 对将来的治疗发展非常有利。现在还不知 道以 RNAi 机制抵抗病毒或者动物病毒基因编码的蛋白对 RNAi 是否起抑制作用 , 但了解 RNAi 系统的作用机制 , 以及其与动物病毒的相互作用是建立以 RNAi 为基础的人类疾病基因治疗 中的重要一环。参考文献 :1 Schena，M. ， Comments( United States Biochemical Corp. )，1989，15(2)，23.2 Mol

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