培养基的制备和灭菌

1、实验六 培养基地制备和灭菌一、目的要求1、了解培养基地配制原理和方法，熟悉分离、培养微生物的有 关准备工作。2、了解几种灭菌方法，掌握加压蒸汽气菌原理及方法。二、实验说明培养基是用人工方法， 将多种生物质按照微生物生长所需要而调 制成的一种营养基质。 由于不同微生物营养类型不同， 对营养物质的 要求也不同， 因此所需要培养基种类也不同。 培养基可分为天然培养 基、合成培养基和半合成培养基三类。根据是否有凝固剂及含有凝固剂的多少又可将培养基分为液体 培养基、固体培养基和半固体培养基。凝固剂一般为琼脂（洋菜）也 有用明胶等制成。三、实验材料1、高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉、烧杯、试管、量筒、漏斗、

2、玻棒、吸管、防水油纸、绳索、棉花、 pH试纸等。2、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、麦芽汁、磷酸氢二钾、硫酸镁、 洋菜、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸亚铁、 1M 盐酸液、 1MNaOH 液等。（一）配制培养基培养基配制 容器中先盛所需水量的一部分（蒸馏水或自来水， 视实验要求而定），然后按培养基配方，称取各种原料，依次加入解， 最后加足所需水量， 如为蛋白胨、牛肉膏等物质， 则需加热使之溶解。在加热过程中所蒸发掉的水分，应待全部溶解后补足。2、调节 pH值 用 pH试纸或其他方法测定 pH 值，以 1M的 NaOH 或 1M的 HC1调节至所需要的 pH 调节至所需要的 pH值。3、溶化凝固剂 如制

3、备固体培养基，应先将琼脂称好洗净，煮 沸已配好的液体培养基， 在沸腾状态下将琼脂加入， 并不断撑拌直至 完全溶解为止。加热水补足所蒸发的水分。过滤或不过滤（视需要而 定）。4、培养基分装 将已过滤好的增基分别按需要分装于锥形瓶或 试管内。分装方法（图 6-1 ）。注意不要使培养基粘附管口或瓶口， 以免浸润棉塞引起杂菌污染。装入试管的培养基量， 视试管大小及需要而定， 一般制成斜面培 养基时，每支小试管（ 15150mm）约装 4-5ml （1/4-4/5 试管高度） 如制深层培养基时，每支试管（ 20 220mm）约装 12-15ml 即可。分 装后，塞上棉塞，包上防水纸，然后进行高压灭菌。按

4、上述步骤分别配制下列培养基：（ 1）牛肉膏白胨培养基（ 2）淀粉培养基（ 3）麦芽汁培养基（4）马铃薯培养基（二）培养基和玻璃器材的灭菌方法常用的灭菌（消毒）的方法，通常可分为四大类： （1）加热灭菌 （包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮佛消 毒）；（2）过滤除菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。在本次实验中只介绍与培养基有关的灭菌方法。1、干热灭菌法（即热空气灭菌法） 干热灭菌一般是利用电热 烘箱作为干热灭菌器。所使用的玻璃仪如试管、三角瓶、培养皿等要 用干热灭菌。灭菌之前要做棉塞或包上牛皮纸（或旧报纸） 。打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内温度达

5、到160关闭通气孔，保持 1-1.5 小时。待温度下降至 60-70 以下，方可打 开箱门取灭菌物器，否则骤冷后易使箱内玻璃器皿破损。2、加压蒸汽灭菌法 加压蒸汽灭菌是利用高压灭菌器，使水的 沸点在密封的灭菌器内随压力升高而增高来提高蒸气的温度和灭菌 的效率的。高压灭菌器的主要构成部分是：灭菌锅、盖、压力表、放气阀、 安全阀等。加压蒸气灭菌操作过程如下：（ 1）加水 在灭菌器内加入一定量的水。（ 2）装料 将待灭菌的物品放在灭菌桶内。包与包之间留有适 当的空隙以利蒸气的流通。（ 3）密封 将盖上软管插入灭菌桶的槽内，上下对齐，拧紧螺 栓，切勿漏气。（ 4）升压 点燃煤气或接通电源，加热至水沸腾

6、，打开排气阀， 排气数分钟，关闭排气阀，升压。（ 5）灭菌 待压力达到一定时，开始计算灭菌时间，同时应减 弱加热使其恒压。6）降压 达到规定的灭菌时间后，关闭煤气或电源，让其自 然降压冷却。（ 7）取料 待压力降至零时，打开排气阀，然后打开灭菌器盖 子 ，取出物品。如需制斜面应趁热摆好（图 6-2 ）。（ 8）倒水 灭菌锅用好后，将锅内剩余水倒掉，以免日久腐蚀。（ 9）将灭菌后的培养基置于 37恒温箱中 24h，作无菌培养。 若无菌生长，可保存备用。3、间歇灭菌法 用阿诺德（ Arnold ）灭菌器或蒸笼灭菌。此种 方法在常压条件下进行灭菌，故蒸气温度不超过 100。适用于没有 高压灭菌设备或不适于加压灭菌的物品。做法是：（ 1）将欲灭菌的物器放入灭菌锅或蒸笼内每天蒸煮一次，每次 半小时，连续蒸煮三次。（ 2）在两次蒸煮之间，将培养基放在 28-30恒温条件下培养。 这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发为营养体， 于下次蒸煮 时杀死。4、过滤除菌法 对某些不耐热的液体物质（如抗生素、维生素 或血清），可用过滤的方法来除菌。（1）过滤除菌法系采用特殊的细菌过滤器（图 6-3 ）来进行。 细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、 硅藻土或石棉等做成， 过滤板的眼 孔很小，细菌不能通过，因此过滤后的液体就无菌体了。（ 2）在进行过滤除菌前， 先将整个过滤器和接受