仪器分析实验

1、仪器分析试验讲义 （第二版） 授课人：李蓉 王小刚 西北大学化工学院食品科学系 2004 年 6 月编制 实验一邻二氮杂菲分光光度法测定铁 一实验目的 1了解 752 型紫外可见分光光度计的构造和使用方法。 2掌握邻二氮杂菲分光光度法测定铁的方法。 （1）吸收曲线的测绘； （2）标准曲线的测绘； （3）未知样中铁含量的测定； 二原理 图 1-1 分光光度计光学系统图 1- 光源 2-进光狭缝 3，6-反射镜 4，7- 透镜 5- 棱镜 8-出光狭缝 9- 比色皿 10-光电调节器 11-硒光电池 12-检流计 1分光光度法及其测量的条件 : 分光光度法主要利用的是物质对光的选择性吸收，按照郎

2、伯- 比尔定律，在一定的线性范围内（即浓度范围内）找出吸光度A 与物质含量之间的定 量关系。主要受显色条件和测量吸光度条件的影响，其中显色条件主要与显色剂的用量、 介质的酸度、显色温度、显色时间以及干扰离子的消除等有关；而测量吸光度的条件则与 入射波长入吸光度范围以及参比溶液等有关。 2 邻二氮杂菲-亚铁配合物：在显色前，首先用盐酸羟胺把 Fe3+离子还原为Fe2+离子，其 反应式如下： 在pH=2-9的条件下，Fe2+离子与邻二氮杂菲生成极稳定的橘红色配合物， 其反应式如 下： 该配合物的IgK稳=21.3，摩尔吸光系数510=1.1 X104。 测定时，溶液酸度控制在pH=5.0，以避免酸

3、度过高导致反应速度过慢，酸度过低 Fe2+离子 水解，从而影响显色；此外，若溶液中存在着可与显色剂生成沉淀（ Bi 3+、 Cd2+、 Hg2+、 Ag+、 Zn2+）或有色配合物（CeT CiT Ni2+）的离子时，应注意它们的干扰作用。 三752 型紫外可见分光光度计的使用 1 打开电源开关，使仪器预热 20 分钟； 2 按“方式键” （MOD）将测试方式设置为吸光度方式； 3按“波长设置”键（p，o）设置想要的分析波长； 4打开样品室盖，将盛有参比和被测溶液（约 2.5 cm ）的比色皿分别插入 比色槽中，盖上样品室盖； 5.将参比溶液推入光路中，按“100%T键调整零ABS 6将被测溶

4、液拉入到光路中，此时显示器上所显示的是被测样品的吸光度值。 四. 试剂 10卩g/mL的铁标准溶液；10%勺盐酸羟胺溶液；0.1%的邻二氮杂菲溶液；1mol/LNaAc 溶液。 五. 实验内容 1. 吸收曲线的测绘：准确移取10卩g/mL铁标准溶液5mL于50mL容量瓶中，加入10%酸 羟胺溶液1mL摇匀，稍冷，加入1mol/L溶液5mL和 0.1%邻二氮杂菲溶液3mL以蒸馏水 稀释至刻度，在 752 型紫外可见分光光度计，用比色皿以蒸馏水为参比溶液，用不同的波 长从570nm开始到430nm为止，每隔10或20nm测定一次吸光度（其中从 530-490nm,每 隔10nm测一次）。然后以波长

5、为横坐标，吸光度为纵坐标绘制出吸收曲线，从吸收曲线上 确定该测定的适宜波长。 2. 标准曲线的测绘：取50mL容量瓶6只，分别移取10卩g/mL铁标准溶液2.0、4.0、6.0、 8.0和10.0mL于5只容量瓶中，另一容量瓶中不加铁标准溶液。然后各加1mL10盐酸羟 胺，摇匀，经2min后，再各加5mL1mol/LNaAc溶液及3mL0.1%邻二氮杂菲，以蒸馏水稀释 至刻度，摇匀。在分光光度计上，用比色皿在最大吸收波长(510nm处，测定各溶液的 吸光度。以铁含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 3. 未知液中铁含量的测定：吸取 5mL未知液代替标准溶液，其他步骤均同上，测定吸光 度

6、。由未知液的吸光度在标准曲线上查出 5mL未知液中的铁含量，然后以每毫升未知液中 含铁多少微克表示结果。 六. 记录及分析结果 比色皿：光源电压： (1)吸收曲线的测绘 波长/ (nm吸光度A 570 550 530 520 510 500 490 470 450 430 试液编号 标准溶液的量/mL 总铁含量/卩g 吸光度 1 0 0 2 2.0 20 3 4.0 40 4 6.0 60 5 8.0 80 610.0100 未知液 七. 课堂提问 1 邻二氮杂菲分光光度法测定铁的原理、反应pH条件、用什麽控制酸度、加 NHOH-HCI 的目的？ 2 为什麽绘制吸收曲线？为什麽在最大吸收波长下

7、测定？每改变用参比液进行重新调 零？ 3为什麽绘制标准曲线？如何绘制标准曲线？是否每测一点必须用参比液进行调零？ 实验二醋酸的电位滴定（间接电位法） 一. 实验目的 1 掌握用酸碱电位滴定法测定醋酸的原理和方法。 2. 学会用二阶微商法计算终点体积（V终点）的方法。 3. 学会用电位滴定法测定和计算 HAC电离常数的原理和方法。 二. 原理 图2-1电位滴定仪器装置 1-滴定管2-滴定池3-指使电极 4-参比电极5-搅拌棒6-电磁搅拌器7-电位计 1. 二阶微商法计算终点体积（V终点）：在酸碱滴定的过程中，利用酸碱中和反应，随着滴 定剂的不断加入，被测物与滴定剂发生酸碱中和反应，溶液的批pH值

8、不断变化。由加入 滴定剂的体积V和测得的pH值，可绘制2pH/V2-V滴定曲线。根据等当点时，二阶微商值 等于零，计算出滴定终点时所消耗的终点体积（V终点）。 2. HAC电离常数的测定： 醋酸在水溶液中的离解如下HAc H Ac 其离解常数Ka H Ac HAc 当醋酸被NaOHS定了一半时，溶液中 根据上式，此时H Ka或pH pKa ；由此可知，醋酸电离常数 Ka的负对数值, 就等于NaOH定一半时所对应的pH值 三. PHS-2型酸度计的使用 1 在去离子水中过夜浸泡玻璃电极使电极活化； 2. 安装电极，调节零点； 3. 用邻苯二甲酸氢甲标准缓冲溶液（pH=4.0）校准仪器； 4. 用

9、蒸馏水洗净电极； 5. 将玻璃电极和甘汞电极插入到待测溶液中，测量溶液的pH值。 四. 仪器和试剂 1. 仪器：PHS-2型酸度计一台；玻璃电极及饱和甘汞电极各一支。 2. 试剂：O.lmol/LNaOH标准溶液，0.1mol/L醋酸，邻苯二甲酸氢钾标准缓冲溶液。 五. 实验内容 1. HAC电位滴定过程中溶液 pH值的测定：准确吸取0.1mol/LHAC溶液20mL于 150mL烧杯 中，用蒸馏水稀释至约100mL加入酚酞2滴，放入电极及铁芯搅拌棒，开动电磁搅拌器， 用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定，测量并记录消耗的NaOH溶液的体积（VNaoH和相对应的溶 液pH值。上述滴定实验做1

10、次。 2 .计算滴定终点时消耗的NaOH溶液的体积数（V终点）: V2 V1 pH pH V 1 V 2 pH V 1 pH V 终占 八、 （内插法） 3. 计算HACK准确浓度（Ga） 其中GaOH为准确标定后的NaOH勺浓度 4. 计算HAC勺值（终点时对应的pH值）: PK a pH 1 PH 2PH V 2V 1 1 y V终点 V1 （内插法） 六. 记录及分析结果 VNaoHmL pH pH/V 2 2 pH/V 七. 课堂提问 1二阶微商法确定滴定终点的方法原理？ 2. 为什麽邻苯二甲酸氢甲溶液也可作为缓冲溶液？ 实验三水的pH测定（直接电位法） 一. 实验目的 1. 了解电位

11、法测定水的pH值的原理与方法。 2. 学习酸度计的使用方法。 二. 原理 图3-1玻璃电极测定pH的工作电池示意图 1. 玻璃电极与甘汞电极插入到被测溶液中组成原电池： 在一定条牛下山测得得电动势仲）H值的关L凡KCl （饱和）Hg2Cl2lHg 但因式中K”无法测得，因此在实际工作中，用酸度计测定溶液的 pH值时，首先必须用 已知pH值的标准缓冲溶液来校正酸度计（即“定位”），根据 上式测得测定液的相对pH值。校正时应选用与被测溶液pH值相接近的标准缓冲溶液， 以减少在测量过程中可能由于液接电位、不对称电位以及温度变化等引起的误差。严 格地讲，一支电极应用两种不同 pH值的缓冲溶液校正，在用

12、一种 pH值的缓冲溶液定 位后，测第二种缓冲溶液的pH值时，误差应在0.05之内。校正后的酸度计可直接用 来测量水或其他溶液的pH值。 三. 221型玻璃电极的使用 1 在去离子水中过夜浸泡玻璃电极使其活化； 2. 将玻璃电极和甘汞电极插入到标准缓冲溶液中溶液中，进行pH值的校正； 3. 用校正后的酸度计测量水溶液的 pH值。 四. 仪器和试剂 1. 仪器：25型酸度计或PHS-29A型酸度计一台；221型玻璃电极及222型饱和甘汞电极 各一支；100mL烧杯4只。 2. 试剂：pH=4.00的标准缓冲溶液（20C）。标准缓冲溶液通常能稳定两个月，其 pH随温 度不同稍有差异。 五. 实验内容

13、 1. 将电极和烧杯用蒸馏水冲洗干净，用 pH=4.00的标准缓冲溶液淌洗电极1-2次，电极 用滤纸吸干； 2. 用pH=4.00的标准缓冲溶液校正酸度计，标准缓冲溶液用完后，可倒回原试剂瓶，反 复使用。 3. 用水样将电极淌洗4-5次后，测量水样，由仪器刻度表上读取 pH值，重复 测量三次。 4. 测量完毕后，将电极和烧杯冲洗干净，妥善保管。 六. 记录及分析结果 f测量次数 测量内容 1 2 3 pH 个别绝对偏差 相对平均偏差 七. 课堂提问 1. 电位法测定水的pH值原理？ 2. 酸度计为什麽要用已知pH的标准缓冲溶液校正? 3. 玻璃电极在使用前应如何处理？为什麽？ 实验四水中微量氟

14、的测定（离子选择电极法） 一实验目的 1了解用F离子选择电极测定水中微量氟的原理与方法。 2了解总离子强度调节缓冲溶液的意义和作用。 3 掌握标准加入法测定水中微量 F离子的方法。 二原理 图 4-1 氟离子测量装置 1 氟离子电极：氟离子电极（LaF3单晶敏感膜电极，内装0.1mo/LNaCI-NaF内参比溶液和 Ag-AgCI内参比电极）是一种电化学传感器，它将溶液中F离子的活度转换成相应的电位。 当氟电极插入溶液时，其敏感膜对 F离子产生响应，在膜和溶液间产生一定的膜电位： 当氟电极（指示电极）与饱和甘汞电极（参比电极）插入被测溶液中组成原电池时， 电池的电动势E与F离子活度的关系 当加

15、入TISAB（总离子强度调节缓冲溶液）时，由于离子活度系数丫为一定值，则电 动势E则与F-离子浓度有如下的关系： 2标准加入法：当试液为离子强度比较大的金属离子溶液，且溶液中存在络合剂，若要 测定金属离子的总浓度（包括游离的和络合的） ，则应采用标准加入法。该法是在原待测 试样（待测离子总浓度为Cx,体积为V0）中，加入少量体积（VS约为原试液体积的1/100 ） 高浓度（Cs约为Cx的100倍）的待测离子的标准溶液，根据加入标准溶液后试样浓度的增 加量Ac,以及标准溶液加入前后电动势的差值 AE,推算出待测金属离子的总浓度 Cx。该 法的优点是仅需一种标准溶液，操作简单快速，适用于组成比较复

16、杂，份数较少的试样。 三7601 型氟电极的使用 1在去离子水中过夜浸泡氟电极使其活化； 2 用去离子水洗到空白电位（ c）在“定量方法表”中选择“计算校正因子”； d）选择“操作”菜单中“定量计算”命令，程序随即将计算结果填入“定量结 果表”中； e）在“定量组分表”中单击“取校正因子”，将刚刚计算得到的但尚在“定量结 果表”中的校正因子取到“定量组分表”中； f）选择“文件”菜单中的“存为摸板”命令将上述文档窗口中的几张表格保存 到当前工作目录下的“默认模板.tab ” ； B）待测样品质量百分含量的计算： a）按谱图处理操作步骤所述采集并处理待测样品的谱图据; b）在“定量方法表”中选择

17、“校正归一”； c）选择“操作”菜单中“定量计算”命令，程序随即将计算结果填入“定量结 果表”中； 4. 仪器的关闭： i 将TCD热导检测器热丝温度设定为关闭； ii. 关闭仪器的总电源，并从电源插座上拔下仪器的电源电缆插头； iii. 关闭载气气瓶总阀； 四. 仪器和试剂 1 仪器：SP-2100型气相色谱仪；微量注射器；氢气钢瓶。 2试剂：101白色担体（60-80 目）;固定液：有机皂土 -34+邻苯二甲酸二壬酯。苯、甲 苯、乙苯单样的标准样品（分析纯）；苯、甲苯、乙苯混合标准样（分析纯）。 五. 实验内容 1. 苯系物的定性分析：根据保留值用苯、甲苯和乙苯的单样标准液定性混合液中的三

18、组 分； 2. 苯系物的定量分析：归一化法计算各组分的含量 i 校正因子的求取：将已知组分量（g）的标准混合溶液用“计算校正因子”法计算出校 正因子； ii .待测样品百分含量的计算（“校正归一”化法计算） 六. 记录及分析结果 打印出实验结果：包括保留时间、组分名称以及质量百分含量等数据结果的色谱图谱。 七课堂提问 1保留值定性分析的原理？ 2如何用面积归一化法进行定量？ 实验六原子吸收光谱法测定自来水中镁的含量 一目的 1掌握原子吸收光谱分析法的基本原理； 2了解原子吸收分光光度计的主要结构，并学习其操作和分析方法； 3学习选择操作条件和干扰抑制剂的应用； 4了解从回收率来评价分析方案和测

19、得结果的方法。 二原理 图 6-1 原子吸收分析示意图 1 标准曲线法测定镁的含量：溶液中的镁离子在火焰温度下变成镁原子蒸汽，光源空心 阴极镁灯辐射出波长为 285.2nm 的镁特征谱线，被镁原子蒸汽强烈吸收，其吸收的强度与 镁原子蒸汽的浓度关系符合朗伯比尔定律，即 镁原子蒸汽浓度N与溶液中镁离子浓度c成正比，当测定条件固定时， 利用A与c的关系，用已知不同浓度的镁离子标准溶液测出不同的吸光度，绘制成标 准曲线，根据测试液的吸光度值，从标准曲线求出试液中镁的含量。 2干扰抑制剂：自来水中除镁离子外还含有其他阴离子和阳离子，这些离子镁的测定能 发生干扰，使测得结果偏低。加入锶离子作干扰抑制剂，可

20、以获得正确的结果。 3回收试验：对于试样的组成不完全清楚的或分析反应不完全引起的系统误差，可以采 用回收试验进行校正。该法是向试样中或标准试样中加入已知含量的被测组分的纯净物 质，然后用同一方法进行测定，由测得的增加值与加入量之差，估算系统误差，并对结果 进行校正。 三. TAS-990型原子吸收仪的操作 1开机 依次打开打印机，显示器，计算机开关，等计算机完全启动后，打开原子吸收主机电源， 打开盖箱。 2. 仪器初始化 i .双击“ AAwin”图标，选择联机方式，点击“确定”，初始化3-5分钟； ii 选择元素灯和预热等（双击元素灯位置，可更改灯位置上的元素符号） 。点击“下一 步”，出现

21、“设置元素测量参数”窗口； iii 设定光谱带宽，燃气流量，燃烧器高度等参数（一般工作灯电流，预热灯电流，负 高压以及燃烧器位置不用更改） ，点击“下一步”，出现“设置波长窗口” ： iv 不要更改默认的波长值，直接点击“寻峰” ，寻峰完毕，出现最大吸收波长对应的吸 收峰，点击“关闭”，点击“下一步”，点击“完成”。 3火焰吸收的光路调整 点击“仪器”下的“燃烧器参数”，输入燃气流量和高度（直接影响吸收值 A的大小），点 击“执行”，用白色滤纸观察光电即燃烧头是否在光路的正上方，若有偏离，更改相应 参数，点击“执行” ，可以反复调节，直到燃烧头和光路平行并位于光路正上方（如不 平行，可通过手动

22、调节燃烧头角度来完成） ，点击“确定”。 4设置样品：点击“样品”图标 i 选择校正方法（一般为标准曲线法） ，曲线方程（一般为一次方程） ，浓度单位，样品 名称和起始编号，点击“下一步” ； ii 输入标准样品的浓度和个数（可依照提示增加和减少标准样品的数量） ，点击“下一 步”； iii 选择需要或不需要空白校正和灵敏度校正（一般为不要） ，然后点击“下一步” ； iv 输入待测样品数量，名称，起始编号，以及相应的稀释倍数等信息，点击“完成” 。 5设置参数：点击“参数”图标，弹出测量参数窗口。 i “常规”：输入标准样品，空白样品，未知样品等的测量次数（测几次计算出平均值） ， 选择测量

23、方式 （手动或自动， 一般为自动），输入间隔时间和采样延时 （一般均为 1 秒）； ii “显示”：设置吸光值最小值和最大值（一般为 0-0.7 ），刷新时间（一般为 300秒）； iii “信号处理”：设置计算方式（一般火焰吸收为连续或高峰） ，积分时间和滤波系数（积 分为 1，系数为 0.3 秒）； iv “质量控制”：适用于带自动进样的设备； 点击“确定”，退出参数设置窗口。 6测量 i 依次打开空气压缩机的风机开关，工作开关，调节压力调节阀，使空气压力为 0.2-0.25MPa ；打开乙炔钢瓶主阀， 调节出口压力为 0.05-0.06MPa ，检查水封； 点击“点 火”图标，火焰稳定后

24、，首先吸喷纯净水（将塑料管插入到蒸馏水中）15mi n,防止燃 烧头结盐； ii 点击“测量”，吸喷空白液（将塑料管插入到空白液中）校零，即线平直后，吸喷标准 溶液，点击“开始”；每测一次标准溶液前，均需吸喷空白液校零，最终得到标准曲线； 按照相同操作方法测量未知样；测量完后，点击“终止” ，退出测量窗口，关闭乙炔钢 瓶主阀，点击“确定” ，退出“熄火提示窗口”吸喷纯水 1 分钟； iii 点击“视图”下的“校正曲线” ，查看曲线的相关系数，决定测量数据的可靠性，点击 “保存”或“打印”处理； 7关机 依次关闭AAwin软件，原子吸收主机电源。乙炔钢瓶主阀，空压机工作开关，按放水阀， 排空气压

25、缩机中的冷凝水，关闭风机开关，退出计算机win dows操作程序，关闭打印 机，显示器和计算机电源。盖上仪器罩，检查乙炔是否已经关闭，清理实验室。 四、仪器和试剂 1、仪器：TAS-990型原子吸收分光光度计，镁元素空心阴极灯，乙炔，空气供气设备；容 量瓶（50mL17支, 100mL1 支）；吸量管（1mL1 支，5mL3支）。 2、试剂：10.00ug/mL镁的标准溶液；10.00mg/mL锶溶液；二级纯盐酸，硝酸，去离子水， 自来水样。 五实验内容 调整波长到285.2nm,灯电流3mA 1、燃气和助燃气比例的选择：调整空气压力为 0.2MPa和流量，使雾化器处于最佳雾化状 态。再用去离

26、子水调 A=0,然后固定乙炔压力为0.05MPQ改变乙炔流量，测量 50mL0.4ug/mL镁标准液（含2.0mL锶溶液）的A值。记录各种压力、流量下的A值（注 意：每改变乙炔流量，都要用去离子水调节 A至零。），经若干次测试后，从记录结果 选择出稳定性好且A值又较大时的乙炔-空气的压力和流量。 2、 燃烧器高度的选择：改变燃气高度，测定上述标准镁溶液的A值，选择出稳定性好且A 值又较大的燃烧器高度。 3、 干扰抑制剂锶溶液加入量的选择：移取自来水样5ml，分别放入6只50mL容量瓶中， 分别加入2mL1 1HCI;六瓶中分别加入0、1、2、3、4、5mL锶溶液，用水稀释至刻度， 摇匀。每次用

27、去离子水调A为零，依次测定各瓶试样的吸光度，由测得的稳定性好且A 值较大的结果，选择出抑制干扰最佳的锶溶液加入量。 4、标准曲线的绘制：于6只50mL容量瓶中，分别加入0、10、20、30、40、50ug镁的标 准溶液，每瓶中加入选得的最佳量锶溶液，每次用去离子水 调零，依次测得各瓶溶液的 A值，以此数据绘制出标准曲线。 5、自来水样的测定：准确移取 5mL自来水样两份，分别置于50mL容量瓶中加入最佳量的 锶溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀；用去离子水调零，测出其 A值，再由标准曲 线查出水样中镁的含量m 流动相：A:0.02mol/LKH 2PQ（pH6.0）; B:0.02mol/LKH

28、 2PO4（pH6.0）+0.5mol/LNaCl ；梯度洗脱 :20minB 从 0 到 100%； 流速:1mL/min ;检测器：UV（入=280nm；进样量 ：15卩L;各蛋白浓度：2.0mg/mL. 三 AKTAPurifier-900 型生物色谱仪的操作 1开机：依次打开计算机、生物色谱仪主机，待色谱仪初始化完毕后，点击“Unicorn ” 图标，输入用户名和密码（均为“ default ”），则 UNICORNMessag、erMethodEditor 、 SystemControl 、 Evaluation 四个窗口同时出现。 2样品测试操作 i 手动式操作： A. 色谱柱的平

29、衡：点击“ SystemControl ”窗口下“ Manual”菜单，选择“ Alarm回到“ Flowpath ”窗口，将样品注 入样品环，选择“inject ”，点击“ Execute ”，开始进行样品的测试；当图谱中红线出 现时（表明样品已进入系统） ，将选择“ Flowpath ”窗口中的“ load ”，让样品环复位。 C系统清洗：选择“ Pump窗口，设定清洗流速，依次将泵头放入水、10%勺乙醇中清洗。 ii .自动操作： A. 方法编辑：在“ MethodEditor ”中选择“新建”图标，选中“ MethodEditor ”，点击“0K， 进入梯度编写程序，按照梯度要求编写成

30、序。编写好后，在“ File ”中选择“ saveas”, 将编辑好的方法保存到设定的文件夹下（一般为 C： .defaultMethod）。 B. 方法运行：在“ SystemControl ”中选择“ Run”，然后从编辑的方法文件中选择出自己 的方法文件，点击“ OK，在“ Result name ”对话框中，点击“ Browse”，选中保存实 验结果数据的文件夹，给出文件名；将待测样品注入样品环，点击“ Start ”，开始进 行样品的测试。 C系统清洗：选择“ Pump窗口，设定清洗流速，依次将泵头放入水、10%勺乙醇中清洗。 3. 数据处理：在“ Evaluation ”窗口中打开

31、保存的数据文件，手动操作的数据结果应在 “C: .default中的ManualRuns （Systeml）”中按时间顺序查找；自动操作的数 据结果应在“ C： .default中自己设定的文件中查找。选择“ File ”里 “OpentoCompare中的“ Curves”进行图谱的对比。 4. 数据输出：在“ Evaluation ”窗口中打开保存的数据文件，得到色谱图，选择“File ” 里“Export ”中的“Curves”，选中图谱的波长，点击“Select ”确认后，点击“Export ”; 选择图谱输出路径以及文件名，点击“ OK,从“ Excel”中打开该文件，即可将色谱 图

32、由ACSII码转化为原始数据，该数据可用“ Excel”或“ Origin ”作图软件，做出对 应的色谱图。 5. 关机：点击“ SystemControl ” 中的“ End键，关闭“ UNICORNMessag”，点击 “SystemControl ”，选中“ Unlock ”，点击“ OK，生物色谱仪主机系统退出（计算机 与主机脱机），依次关闭生物色谱仪和计算机。 四. 仪器和试剂 1. 仪器：AKTAPurifier-900型液相色谱仪；IDA-硅胶柱；微量注射器。 2 .试剂：BSA RNase Cyt-C、Lys标准液（1mg/mL，以及标准蛋白混合液；其它试剂均 为分析纯；水为二

33、次蒸馏水。 五. 实验内容 1.标准蛋白的定性分析：根据保留值用蛋白单样标准液定性混合液中的四组分； C=1mg/mL 进样量 10 pL 标准蛋白混合物BSA Cyt-C RNase Lys t R 2. 标准蛋白的定量分析：归一化法计算各扥白组分的含量 i .校正因子的求取：将已知组分量（g）的标准混合溶液用“计算校正因子”法计算出校 正因子; C=1mg/mL 进样量 10 pL 标准蛋白混合物BSA Cyt-C RNase Lys m (g) ii .待测样品百分含量的计算（“校正归一”化法计算）： 六. 记录及分析结果 打印出实验结果：包括保留时间、组分名称以及质量百分含量等数据结果

34、的色谱图谱。 七课堂提问 1离子交换色谱分离蛋白的机理？ 2保留值定性分析的原理？ 3如何用面积归一化法进行定量？ 实验八小鼠肾脏组织蛋白的双向电泳分离 一实验目的 1. 掌握2-DE电泳仪（PROTEANIEFCel等点聚焦仪，PROTEANXi垂直电泳槽）的操作。 2掌握2-DE分离蛋白质组的原理。 3. 掌握2-DE定性分析方法。 4. 掌握2-DE定量分析方法。 二. 原理 图 8-12-DE 电泳仪 1. 2-DE分离原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第 二向SDS-PAG是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就 从两方面对蛋白

35、质进行分离，最终得到蛋白质等电点和分子量的信息。如图 8-2 所示： 图 8-2 被动式再水合低分子区小鼠肾脏组织蛋白的 2-D 图谱 17cmpH3-10IPG胶条，200X 200X I.OmmSD韵一胶（12% , 120ug 上样量，银染 2. 2-DE定性原理：通过蛋白质组凝胶图谱的对比，根据同一蛋白点在凝胶上所处的位置 相同进行定性。 3. 2-DE定量原理：通过蛋白质组凝胶图谱的对比，根据蛋白点颜色的深浅、以及蛋白点 的大小进行初步定量。 三、2-DE操作步骤 （一）第一向等电聚焦 1. 水化液的制备： i从冰箱中取-20 C冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT不含Bio-

36、Lyte ） 一小管（1ml/ 管），置室温溶解。 ii 在小管中加入 0.01gDTT,溴酚兰，3.5ul （0.5%v/v ） IPGbuffer（pH3-10）振荡混匀， 13200rpm离心15min除杂质，取上清。 iii从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，振荡器上振荡混合，13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。 2. 点样、上样 i从冰箱中取-20 C冷冻保存的IPG预制胶条（17cmpH3-10,室温中放置10分钟。 ii沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样， 中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡

37、。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 iii 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制 IPG 胶条上的保护层。 iv将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对 应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料 支撑膜上。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子 轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。 v 在每根胶条上覆盖 2-3ml 矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物 油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 3. IPG聚焦系

38、统跑胶程序的设定（跑胶温度为 20C） i 对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序： S1、S2、S3、S4、S5； 其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦 ii聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向 SDS-PAG电泳，否则将胶条置于样品水化盘 中，-20 C冰箱保存。 （二）平衡 1. 配制胶条平衡缓冲液 I 。在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚 滤纸上。将另一份厚滤纸用 MilliQ 水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上， 轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在 有胶条的槽中加入 5ml 胶条平衡缓

39、冲液 I 。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。 2. 配制胶条平衡缓冲液 II 。第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平 衡缓冲液 I 。并滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝 胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液 II ，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15分钟。 （三）第二向SDS-PAG电泳 1. 配胶、灌胶 i配制10%勺丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃 板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ 水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平 整，聚合30分钟。 ii待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的 Milli

40、Q水、乙醇或水饱和正丁醇，用 MilliQ水冲洗 2. 转移 i从-20 C冰箱中取出的胶条，先于室温放置 10分钟，使其溶解。用滤纸吸去SDS-PAG聚 丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃 板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 ii将琼脂糖封胶液进行加热溶解。11.将10倍电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，制成1倍 电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 iii第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II o并用滤纸吸 取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。将IPG胶条从 样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一

41、端使胶面完全浸末在1倍电泳缓冲液中。然 后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。 其余胶条同样操作。将放有胶条的SDS-PAGE 凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶 液。 iv用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完 全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时， 要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶 液彻底凝固。在低熔点琼脂糖圭寸胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。 3 跑胶 i在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/1

42、7cm）或低电压， 待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压） （20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 ii电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。 （四）银染 固定敏化洗涤银染洗涤显影终止洗涤 一一*一一 注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。 四. 仪器和试剂 1. 仪器：PROTEANIEFCel等点聚焦仪，PROTEANXi垂直电泳槽（Bio-Rad公司）；玻璃 匀浆器（陕西化玻器械有限公司）;TGL-16G-A高速冷冻离心机（上海安亭科学 仪器厂）；电热恒温水浴

43、锅（北京化玻联医疗器械有限公司）；ULTFreezer （美 国 ThermoForma公司）。 2. 试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris），两性离子表面活性剂（CHAP）苯甲基磺酰氟（PMSF）, 二硫苏糖（DTT）,丙烯酰胺（Acrylamide ） , N,N -甲叉双丙烯酰胺（N,N -Methylenebisacrylamide ）,过硫酸铵（APS ,十二烷基磺酸钠（SDS ,四甲 基乙二胺（ TEME）D 溴酚蓝（ BromophenolBule） 2-巯基乙醇（ 2-ME） 低分子 量标准蛋白质均购自华美生物工程公司；载体两性电解质（ CA pH=3.5-9.5 ） 购自北京经科

44、宏达生物技术有限公司；矿物油（ SiliconOil ） IPG 干胶条均购 自 Bio-Rad 公司；其他试剂均为国产分析纯。 五. 实验内容 1. 样品的溶解 预冷生理盐水冲洗鼠肾脏组织 3 次 迅速将清洗的组织分割成适宜的小块 滤纸吸取 多余的液体,称量 50mg湿组织,放入玻璃组织匀浆器中加1mL裂解液（裂解液I : 9.5mol/LUrea+40mmol/LTris+4%w/vCHAPS ;裂 解 液 n : 9.8mol/LUrea+40mmol/LTris+4%w/vCHAPS+1mmol/LPMSF+1mmol/LEDTA+65mmol/LDTT+0.5% v/vIPGbuff

45、er ）,冰浴中匀浆,冰上静置 10-15min , 17C下,15000rpm离心10min；取上 清，用LOWOF法定量，蛋白浓度约为20mg/mL分装于小离心管中，-78 C下冻存备用； 取一定量上述样品液，加再水合液（8mol/LUrea+2%w/vCHAPS微量溴芬兰）稀释至终体积 300卩L ,混匀后室温下静置1hr ,离心后即为含样品的再水合液。 2. 凝胶电泳 移取含有适量蛋白浓度的泡胀液 300uL 采用被动式和主动式（加 50V 低压）的胶内样品 再水合法泡胀17cm的IPG胶条16hr。按照IEF程序20C下恒温等电聚焦：0150V40min （线性）；150500V40

46、min（线性）；5001000V1h（线性）；5001000V1h（线性）；1000 2000V1hr （线性）；20003000V1hr （线性）；30004000V1hr （线性）；40006000V1hr （线性）；60008000V1hr （线性）8000V4hr （快速）。聚焦后IPG胶条在6mL平衡缓冲液 中（ 1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）+6molLUrea+2%（w/v）SDS+30% （v/v ）甘油）平衡 30 分钟。 配制200 x 200X 1.0mm的 12%勺SDS-PAG凝胶，室温下聚合1hr。平衡后的IPG胶条转移 至第二向，恒流下按照 SD

47、S-PAG跑胶程序进行：16mA/gel, 30min； 24mA/gel，电泳至指 示线达凝胶的底边，终止电泳。 3银染 胶片固定过夜（乙醇100mL冰醋酸25mL加蒸馏水至250mL;水洗2X 1min；敏化 30min （乙醇75mL戊二醛（25%w/v）1.25mL,硫代硫酸钠（5H2O）5%w/v,醋酸钠17g，加蒸馏水 至250mL ；水洗3X 10min；银反应30min （硝酸银2.5%（w/v）,甲醛37%（w/v）,加蒸馏水至 250mL ;水洗2X 1min；显色15min（碳酸钠25g,甲醛400卩L,用蒸馏水溶解至1000mL）, 共换液3次；终止反应10min（Na

48、2EDTA.HO3.65g,加蒸馏水至250mL）;水洗3X5min。 六记录及分析结果 将2-DE胶片扫描，用图谱分析软件进行分析，打印出含有操作条件参数的2-DE图谱。 七课堂提问 1. 2-DE2-DE分离蛋白质组的原理？ 2 如何用2-DE进行定性分析方法？ 3. 如何用2-DE进行定量分析方法？ 4. 为了获取高重现性、高分辨率的 2-D图谱在2-DE的操作过程中，应有哪些注意事项？ 实验九蛋清中溶菌酶的飞行质谱（MALDI-TOFM;S 鉴定 一. 实验目的 1 .掌握的飞行质谱（MALDI-TOFMS操作。 2. 掌握MALDI-TOFM鉴定蛋白质的原理。 二. 原理 1. 基本

49、原理：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF-MS是近年来发展起来的一 种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。仪器 主要由两部分组成： 基质附助激光解吸电离离子源 （MALD;I 和飞行时间质量分析器 （TOF;。 其构造如图8-1。MALDI的原理是用激光照射样 基质与分析混合物靶盘图9-1MALDI-TOFMS原理简图 品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质 子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电 离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电

50、场作用下加速飞过飞 行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的 检测器检测器 飞行时间成正比，检测离子。根据离子轨迹和离子提取模式可将TOF-MS分为线性TOF-MS (LinearTOF-MS),反射式 TOF-MS( ReflectronTOF-MS )以及延迟离子提取线性 TOF-MS (DelayedlonExtractionLinearTOF-MS )三种，本实验采用的是线性 TOF质量分光计，其 装置如图8-2所示： 线性TOF质量分光计 图9-2线性TO质量分光计的基本组成 MALD加速OF-M具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科

51、学等领域提供了一种 激光场自由漂移区 :手段，并正扮演着越来越重要的作用。 强有力的分析j 2.基质的选择： 吸附。样品离子化的机理实际上就是质子在基质与样品间的转移见下式: V 质是可吸收紫外的低分子量化合物，其作用有助于样品盘上样品的解 连续离子提取 :G1 G2 MH 脉冲电BCm+ABCH +(1) 其中M代表基质，ABC代表分析物样品。基质偏选择通常与各种样品如蛋白质、肽、 延迟离子提取：G1 (电压) 一 G2电压 等的分子特性有关。在 maldi-tofM分析过程中，基质的选择是 脉冲持 很大程度上影响MALDI的分析结果间一方面续每种蛋白质具有能结合到特异基质晶格的独 特结构；

52、另一方面，每一种基质有其独特的物理特性，它们会以不同的方式与不同的蛋白 延迟离子提取 :G1 (电压) DNA G2电压=偏转电压 卜分重要的，它往往会在 分析物进行作用。因此，同一类基质不 表9-1337nm下常用的MALD基质 基质 应用范围 4000Da的多肽 2,5-二羟基苯甲酸(DHB) -氰基-4-羟基-苯基-2-丙烯酸(CHCA 8000Da的多肽 3,5-二甲氧基-4-羟基苯基-2-丙烯酸(SA) 8000Da的蛋白 定适合所有的蛋白质，而基质的选择则通常取决于蛋白分子的特异性。表 9-1给出了在 337nm氮激光照射下常用的MALDI基质及其应用范围，这几种基质的化学结构图见

53、图9-3 : gentisicacid(DHB) 2,5-二羟基苯甲酸 Sinapinicacid(SA) 3,5-二甲氧基-4-羟基苯 基-2-丙烯酸 3.分子量的测定：分子量是有机化合物最基鉴定的理化性质参数 表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。 CHCA -氰基-4-羟基-苯 基-2-丙烯酸 分子量正确与否往往代 MALDI-TO F是一种软电离技术, 不产生或产生较少的碎片离子，它可直接应用于混合物的分子量的测定，也可用来检测样 品中是否含有杂质及杂质的分子量。MALDI-TOFI勺准确度高达0.1%-0.01%，远远高于目前 常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前

54、可测定生物大分子的分子量高达600KDa m/z （b）IDA裸柱分离纯化的馏分 图9-4蛋清中溶菌酶的 MALDI-TOF质谱图 质谱条件：线性正极脉冲提取模式，氮激光源（=337nm）;激光能量约90个单位；激光照射累 积次数:100次;基质：-氰基-4-羟基-苯基-2-丙烯酸（CHCA;样品体积：饱和基质液体积为1:1 三、KratosPCAximaCFR型 MALDI-TOFM的操作步骤 （一）开机 1. 开主机总电源至ON（此时分子泵启动）。 2. 开机诫泵电源至ON必要时振气30分钟。 3. 开主机正面有钥匙的开关至ON（顺时针）。 4. 开计算机及显示器，启动 FLEXcontr

55、ol软件。 5. 等待源高真空达到3X 10-6mbar，如达不到该数值，检查是否有漏气发生。 6. 打开高纯氮气（纯度99.999%以上）钢瓶，使激光器内氮气压力为1700mbar左右并保持 稳定。 7. 进入日常操作。 （二）关机 1. 将靶退出。 2 .在 FLEXcontrol 界面的 Spectrometer 关掉高压 HV （按“ OFF ）。 3关闭所使用的软件，关闭计算机。 4. 关主机正面有钥匙的开关至 OFF（逆时针）。 5. 关机诫泵电源至 OFF。 6. 关主机总电源至 0FF。 （三）日常操作 1. 打开 FLEXcontrol 进入仪器控制界面。 2. 确认真空度为

56、 10-7mbar 或稍低。 3. 通过界面Carrier 或主机正面的LoadEJECT开关，将样品靶放入仪器，等待约2分钟, 调整好靶位。在此过程中不应操作软件或硬件，以确保仪器通讯畅通。 4. 根据测量目的选择测量方法 i 分子量测定：根据分子量大小选择相应的线性测量方法和仪器校正方法。 ii 肽质量指纹谱测量：根据所需测量的肽谱范围选择相应的反射测量方法和仪器校正方 法。 iii 根据需要选择正离子或负离子测量方法和仪器校正方法。 iv酌情选择FAST方法。 v 选择适当的仪器参数 6.测量 i 手动测量 b根据图谱的质量按Add添加或按ClearSum删除图谱。 c. 按SaveAs

57、保存图谱。 注：在测量过程中可随时调整激光能量和靶位置以获得最佳信噪比和分辨率。 ii 自动测量 a. 按菜单 AutoXecute，再按Select选择一个Sequenee文件名。 b. 按Edit编辑待测样品，用 Sampleposition 的Sample依次选定靶位后按 Add添加到 EditAutoXecuteSequence 中。 c. 按AutoXecuteMethod选择Calibration 或样品测量方法。 d. 按Edit设定激光能量、靶位移动、累加方法等参数并保存该参数。 e. 按StartAutomaticRun 开始自动测试。 iii 处理图谱 a. 打开XTOF进

58、入图谱处理界面。 b. open 菜单选择待处理的图谱。 c. 标峰：a）反射模式标单同位素峰；b）蛋白质线型测量模式时标平均峰。 d. 打印图谱。 （四）注意事项 1. 关机时氮气可不关，可将压力适当调低，以免仪器受潮。 2. 手动测量过程中随时注意仪器的漂移，若有漂移需用标肽或标准蛋白校正仪器。 3. 一定注意氮气的纯度不低于 99.999% 4换氮气钢瓶时应先将激光器的电源关闭，将气管吹干净后方可接入激光器。 5要得到一张满意的图谱，必须调整合适的激光能量。 6关机时应先关高压后再退出 FLEXControl 。 7须等待样品靶点完全干燥后才能将靶放入仪器，且不宜过夜。 四仪器和试剂 1

59、. 仪器：KratosPCAximaCFR型基质辅助激光解吸附离子-飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS （Axima-CFR科拉托斯分析，曼彻斯特，英国），软件版本2.2.1,氮激光源（=337nm）（激 光科学国际公司， Franklin,MA,USA ）；气流干燥仪（科拉托斯分析，曼彻斯特，英国） ； 振荡仪（德国）；电子天平（土 0.1mg）;四蒸水制备仪（美国）；2 L移液枪和20 L移液枪 （德国）。 2 .试剂：-氰基4 羟基-苯基-2-丙烯酸（CHCA,乙腈和三氟乙酸（TFA）均购自 Sigma-Aldrich（Steinheim, 德国 ） 。其它试剂均为分析级；双蒸水为本

60、实验室自制，试验 用水为四蒸水。 五.实验内容 1. 饱和基质液的配制 称取-氰基4 羟基-苯基-2-丙烯酸（CHCA7-10mg,溶解于1mL含有30%勺乙腈和0.1% 的三氟乙酸（TFA）的四蒸水溶液中，在震荡仪上充分震荡溶解，制成饱和基质溶液。饱和 基质溶液应新鲜配制，配置好后应储存在冰箱中，最多放置不应超过一星期。 2. 溶菌酶样品的准备 取5 L经透析包埋后的NaCI盐析粗提液（稀释约5倍）和5 L经透析包埋后的IDA 柱分离纯化馏分与新鲜配制的饱和基质CHCA溶液按1:1的体积比（样品体积：饱和基质 液体积）混和。在震荡仪上充分震荡混匀。各取 1 L 样品液和饱和基质溶液按位置直接