响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取条件

1、响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取条件2011 年 9 月 第 13 卷 第 9 期 中 国 现 代 中 药 ModernChineseMedicineSep.2011Vo1.13No?9工艺响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取条件李光,李学兰 ,孙慧峰,刀兆玲(1.中国医学科学院药用植物研究所云南分所 ,云南景洪 666100;2.黑龙江中医药大 学药学院 ,黑龙江哈尔滨 150040;3.云南中医学院 ,云南昆明 650500) 摘要目的:应用响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取的最佳工艺条件,为应用于生产提供参考 .方法:在单因素试验的基础上 ,采用响应曲面法的中心组合设计 ,考察分析提取温度 ,提取

2、时间,提取次数 ,液料比 4 个主 要因素对石斛多糖提取率的影响 ,对铁皮石斛多糖的提取工艺参数进行优化分析.结果:铁皮石斛多糖提取的最优条件为:提取温度为100oC提取时间为2.5h,料液比1:17.2(U V),提取次数为3次. 在此条件下 ,理论计算提取率达到 51.12%,实测提取率为 51.08%,与模型高度拟合 .结论:该工艺便捷 ,快 速,易操作，得率较高，可用于铁皮石斛多糖的提取 . 关键词铁皮石斛;多糖;响应曲面法 ;提取工艺 石斛多糖是铁皮石斛 DendrobiumofficinaleKimu raetMigo中最主要的有效成分J.现代药理学研究 表明,铁皮石斛中石斛多糖具

3、有较强的药理活 性引,具有较高的开发价值 .影响铁皮石斛多糖提 取率的因素很多 ,如提取温度 ,提取时间 ,提取次 数,物料比等 ,常规优化方法得到的提取工艺不能全面展示各因素间的相互影响 ,实际操作过程中造 成很多产量损失 .目前多糖提取工艺研究多采用正 交试验设计 ,但该方法不能在给出的整个区域上找 到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回 归方程 ,从而无法找到整个区域内因素的最佳组合 和响应值的最优值 .响应曲面法以其试验次数少 , 周期短 ,求得的回归方程精度高 ,能研究几种因素 间交互作用的诸多优点 ,在很大程度上满足了这些 要求.目前,多种植物多糖都用响应曲面法进行测 定 ,

4、都能够优化得到很好的提取率 .关于响应曲 面法优化铁皮石斛多糖提取工艺方面的研究尚未见 有报道 ,作者在单因素试验的基础上 ,采用响应曲 面法对铁皮石斛多糖的提取温度 ,提取时间 ,提取 次数,液料比 4个因素的 3 个水平进行中心组合试 验研究 ,分析得出最佳提取工艺参数 ,以为今后扩 大应用和工业化生产提供依据和参考 . 1材料,仪器与试药1.1 材料 铁皮石斛 （购自西双版纳增靓生物科技有限公司 ）.1.2 仪器 数显恒温水浴锅 （国华电器有限公司 ）,电子 天平（赛多利斯公司 ）,分析天平 （赛多利斯公 司 ）,SHB.IV 双 A 循环水式多用真空泵 （郑州长城 科工贸有限公司 ）,

5、TGL16M 湘智离心机 （安徽诚 信启动设备有限公司）,uV.19O1分光光度计（北京 普析仪器有限公司），旋转蒸发器RE 一 52A（上海亚 荣生化仪器厂 ）,GZX-914OMBE 数显鼓风干燥箱 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂 ）,玻璃仪器气 流烘干箱 （武汉科尔仪器设备有限公司 ）.1.3 试药D 一无水葡萄糖对照品 （ 中国药品生物制品检定 所）,水为超纯水 ,乙醚（分析纯 ,天津市风船化 学试剂科技有限公司 ）,无水乙醇 （分析纯 ,天津 市风船化学试剂科技有限公司 ）,苯酚（分析纯 , 天津市大茂化学试剂厂 ）,浓硫酸 重庆川东化工 （集团 ）有限公司化学试剂厂 ,三氯甲烷

6、（分析 纯 ,天津市风船化学试剂科技有限公司 ）. 2方法2.1 铁皮石斛多糖提取工艺精密称取铁皮石斛干燥粉末0.5000g（过3号 筛）,置圆底烧瓶中 ,按设定的提取条件 （液料比 , 提取温度,提取时问,提取次数）进行回流提取, 提取时将反应容器置于恒温水浴锅中 ,提取反应完 成后 ,待料液冷却后通过抽滤进行汁渣分离 ,弃去 基金项目 中央级公益性科研院所基本科研业务专项 （YZYN10-01）通讯作者李光,Tel:（0691）2136981;E-mail:lhbg311hotmail.corn?29?2011 年 9 月 第 13 卷 第 9 期 中 国 现 代 中 药 ModemChi

7、neseMedicineSep.2011Vo1.13N0.9沉淀,得多糖浸提液 ,提取液置 250mL 容量瓶中 定容.将以上所得的提取液，分别精密量取1mL滤液 置 10mL 的离心管中 ,精密加入 5mL 无水乙醇 ,摇 匀，冷藏1h,取出,离心（转速为4000r?min） 20rain,弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次， 每次10mL，弃去上清液,沉淀加热水溶解，转移 至25mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得.2.2 标准曲线的制备 取无水葡萄糖对照品适量 ,精密称定 ,加水制 成1mL中含90g的溶液，精密量取对照品溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL分别置 1

8、0mL 具塞 试管中，各加水补至1.0mL,精密加入5%苯酚溶 液1mL（临用配制），摇匀，再精密加硫酸5mL, 摇匀，置沸水浴中加热20min,取出，置冰浴中冷 却5min,以相应试剂为空白，在488nm波长处测 定吸光度 ,以吸光度为纵坐标 ,浓度为横坐标 ,绘 制标准曲线 .2.3 多糖含量测定 采用苯酚一硫酸法驯 .2.4多糖提取率的计算多糖提取率/%= X 10.%2.5单因素及响应面优化试验设计 通过单因素试验和查阅文献资料确定出提取温 度,提取时间 ,提取次数 ,料液比对铁皮石斛多糖 含量有显着影响 ,为了选择最佳提取条件 ,依据单 因素试验结果，应用DesignExpert8.

9、05b软件进行 实验设计 ,分别考察提取温度 ,液料比,提取时间 和提取次数对铁皮石斛多糖得率的影响并进行优化 详见表 1.表1BoxBeh nken设计因素水平表3结果3.1 葡萄糖标准曲线 实验制备葡萄糖标准曲线 ,得到回归方程 A= 10031C 一 0.0404,r=0.9994回归分析表明，在0.030.16mg?mL葡萄糖的质量浓度与吸光度呈 良好线性关系 .3.2 水提法提取铁皮石斛多糖的单因素影响3.2.1 提取温度对铁皮石斛多糖提取量的影响温 度直接影响物质在水中的溶解度 ,因此对多糖提取 率会有比较显着的影响 .本实验在液料比 40:1,提 取时间1.5h,提取3次的条件下

10、，将温度设定在 70,75,80,85,90,95,1000 7 个温度,研究温 度对铁皮石斛多糖提取率的影响 ,结果见图 1.图 1 提取温度对提取率的影响 3.2.2提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响在 提取温度100cC液料比40:1,提取3次的条件下， 考察提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响 ,结果 见图 2.醛4540353O252Ol5l0提取时间 /h图 2 提取时间对提取率的影晌3.2.3液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响提取温 度100oC提取时间2.5h提取3次的条件下，考察 液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响 ,结果见图 3. 阻3液料比对提取率的影响3.2.4提取次数对铁皮

11、石斛多糖提取率的影响在提取温度100C,液料比30:1,提取时间2.5h的条 件下 ,考察提取次数对铁皮石斛多糖提取率的影响 , 结果见图 4.O00OOO0OOO赢2011 年 9 月第 13 卷第 9 期中国现代中药 ModemChineseMedicine 吝.46.45.44.43.42.41.40.39图 4 提取次数对提取率的影响 3.3模拟组合结果见表 2.表 2Box-Behnken 设计实验结果/%由表 2 可知,通过对提取温度 ,提取时间 ,料液 比,提取次数进行试验优化设计 ,得到相应的二次方程模型:丫=0.35820+0.011091A+0.014902B+0.0103

12、43C 一 9.19026x10 D+0.037041AB 一0.081217AC+0.066108AD 0.042538C+3.61557X 10 一 D. 表3为试验结果进行拟和的二次模型方差分析 , 二次模型中回归系数的显着性检验表明 ,因素 c 对提取效果的线性效应显着 ,因素 AC 对提取效果的 交互影响显着 .回归 F 值为 3.59,多元相关系数为 r=62.96%,说明模型对试验实际情况拟合较好； P=0.0091（P<0.01 视为模型拟合极显着 ）,表明 该模型高度显着 ,可用来进行响应值的预测 ,试验 设计方案正确 .表 3 回归分析结果注:表示极显着差异，P&It

13、;0.01;表示显着差异，P<0.053.4 响应曲面与等高线分析 根据回归模型作出相应的响应面和等高线 ,见 图57,比较两组图响应面最高点和等高线可知， 在所选范围内存在极值 ,即响应面最高点同时也是 等高线最小椭圆的中心点.通过表 3 回归分析结果可见 ,自变量（提取温度 与物料比交互作用 ,提取温度与提取次数 ）与响应值（提取率）之间线性关系极显着（P<0.01）,物料比 的二项式达到显着水平 （P<0.05）. 由表 3 可知, 各因素对多糖提取率的影响顺序 :提取温度与液料 比交互项 > 提取温度与提取次数交互项 > 液料比二 次项>提取温度与提

14、取时间交互项& gt;提取时间一次 项>提取温度一次项>液料比一次项>提取次数- 次项 > 提取次数二次项 .Design Expert8.0.5软件处理得响应面分析结果 31.2011 年 9 月 第 13 卷 第 9 期 中 国 现 代 中 药ModernChineseMedicineSep.2011Vo1.13No.9见图57.由图可知,因素提取温度,提取时间,液料比 ,提取次数交互影响很复杂 ,可能是由于在提取过程中多糖出现水解情况造成的 .1O 厦 善.?O1埒 提取1.000.500.000.5O1.0O提取温度图 5 提取温度与提取时间对多糖提取率的影响

15、l0 丑 荽001料液1.0O.0.500.000.501.00提取温度提取温度图 6 提取温度与液料比对多糖提取率的影响?32?骚 提取率 讲 提取次 图 7 提取温度与提取次数对多糖提取率的影响 由 DesignExpert8.0.5 软件得到优化条件的处 理，确定最优提取工艺关键因素为提取温度100C ,提取时间2.5h料液比1:17.2(rn/V),提取次数 为 3次,理论计算提取率达到 51.12%.在此基础 上进行验证实验 ,实测提取率 51.08%,与预测值 较接近.4 讨论 本实验通过响应面试验设计方法考察了提取 时间,提取温度,提取次数和液料比对石斛多糖 提取率的影响 .二次

16、方程的模型 (总)回归极显 着差异 ,且第二次方差分析后的失拟项检验不显 着,说明通过本实验所建立的二次回归方程成功 地反映了所考察的 4 个因素与响应值之间的相关 性,试验设计科学合理 ,在提取石斛多糖的过程 中提取温度和液料比的交互项影响极显着,实验结果表明 ,石斛多糖提取工艺过程中 ,随物料比增加 产率降低 ,这可能是由于石斛多糖溶解性好 ,少量 溶剂就能够很好溶解 ,由于得到石斛多糖溶液比较 黏稠,在过滤过程中损失较大 ,所以较小液料比能 够得到较大得率 .最终方程模拟得到石斛多糖提取最佳工艺条件为提取温度100oC提取时间2.5h,料液比1:17.2(m/V),提取次数为3次,理论计

17、算提取率达到 51.12%.在此基础上进行验证实2011 年 9 月 第 l3 卷 第 9 期 中 国 现 代 中 药 ModernChineseMedicineSep.201lVo1.13No.9验,实测提取率 51.08%,与预测值较接近 .这种 优化提取方法可以在石斛多糖提取工艺研究中进一 步推广.参考文献1 高正华，杨兵勋,陈立钻铁皮石斛的研究进展J中国 现代应用药学杂志 ,2008,25(8):692-695.2 吕圭源,陈素红,张丽丹,等.铁皮石斛对小鼠慢性酒精性肝损伤模型血清2种转氨酶及胆固醇的影响J中国 实验方剂学杂志 ,2010,16(6):192193.3 张红玉，戴关海，

18、马翠，等.铁皮石斛多糖对S 一(180)肉瘤小鼠免疫功能的影响J.浙江中医杂志，2009,44(5):380 381.4 鲍素华,查学强,郝杰,等.不同分子量铁皮石斛多糖体外抗氧化活性研究J.食品科学,2009,70(21):123-127.5王令仪 .石斛多糖和生物碱测定及多糖抗衰老实验研究D. 遵义:遵义医学院 ,2009.黄森，查学强,罗建平，等.BoxBehnken法优化提取霍山 石斛活性多糖的研究IJ.中药材,2007(5):591594.7孟宪军,李冬男,汪艳群,等.响应曲面法优化五味子多糖的提取工艺J.食品科学,2010,31:1】l I】5.81 董艳红,李姝婧,郑惠华,等.响

19、应曲面优化超声波提取灵芝多糖工艺研究J.食品科学,2009,30(16):98-101.9朱彩平,高贵田,李建科,等.响应曲面法优化微波辅助提取平菇多糖工艺研究J.食品科学,2010,31：6872.10王安良,云霞,杨红.响应曲面法优化山药中多糖的微波提取工艺J.食品科技,2007,194(12):86-90.(收稿日期 2011-06.30) OptimizationofExtractionofDendrobiumcandidumP0lysaccharidesUsingResponseSurf aceMethodologyLIGuang,LIXue lan,SUNHuifeng,DAOZh

20、aoling (1.YunnanBranch,rtituteOfMedicinalPlant,ChineseAcademyofMedicalSciences,Pek ingUnionMedicalCollege,Jinghong666100,China;2.CollegeofPharmacy,HeilongfiangUniversityOfTraditionalCh ineseMedicine,Harbin15(X)40,China;3.YunnanUniversityOfTraditionalChineseMedicine,Kunming65 0500,China)AbstractObjec

21、tive:Toobtaintheoptimalconditionsofultrasonic assistedextractionofpolysaccharidesfromDendrobiumcandidum.andtoprovidethetheoreticalfoundationforthefurtherprocessinga ndutilizationofDendrobi UlTtcandidum.Methods:Onthebasisofthesinglefactortest,responsesurfacemethodology wasappliedtooptimize themainextractionconditions.Results:Theresultsshowedthatextractiontime,water feedratioandextractiontem peratureallhadsignificanteffectsontheextractionrateofpolysaccharides.Obviouscorrelati onwasf0undtobeexisted betweenextractiontimeandextractiontemperature.Theoptimalextractiontimewas2.5han dtheo