反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定(一)

1、反义 cortactin 基因真核重组质粒的构建及鉴定 （一）作者：许朱定，宋振顺，安家泽，李韧，张福琴，窦科峰【关键词】 ,基因表达Constructionandidentificationofrecombinanteukaryoticexpressionvectorof humanantisensecorticalactinassociatedproteingene【 Abstract 】 AIM:ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0/corta ctincontainingfunctionalregionofh

2、umanantisensecorticalactinassociatedpr oteingene(cortactin),soastoprovideatoolforthefurtherstudyontheimpactofc ortactininhepatocellularcarcinoma(HCC)metastasis.METHODS:TotalRNAwa sextractedbyusingTrizolonestepmethodfromcelllineMHCC97.CDNAwasamp lifiedusingreversetranscriptasepolymerasechainreaction(

3、RTPCR).Productof PCR,amplifiedbybeingtransformedintoE.coliDh5 ,wasinsertedreverselyinto theeukaryoticexpressionvectorafterdigestionandligationusingrestrictionen donucleasesandligase.RESULTS:ThecorrectcortactincDNAclonewasobtaine danditwasconfirmedthatcortactincDNAwasinsertedreverselyintotheeukary ot

4、icexpressionvectorcorrectlyusingPCR,digestionidentificationandsequenci ng.CONCLUSION:TherecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0/co rtactinissuccessfullyconstructed. 【 Keywords 】 geneexpression;highlymetastaticHCCcelllineMHCC97;reversetranscriptase polymerasechainreaction;humancorticalactinasso

5、ciatedprotein(cortactin)【摘要】目的：构建一个包含人皮层肌动蛋白( cortactin)反义基因的 全部功能区的重组真核表达载体 pcDNA3.0/cortactin，为进一步研究人 皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础.方法： Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株 MHCC97 总 RNA，经逆转 录聚合酶链式反应( RTPCR)扩增目的片段， PCR产物及真核表达载体 分别双酶切后进行连接， 并转化入大肠杆菌 Ecoli.Dh5 扩增以获得重组 载体.结果： RTPCR获得预期大小的特异性 DNA片段，经 PCR、双酶切 鉴定及测序证实已将

6、人皮层肌动蛋白基因 cDNA 片段正确的反向插入 真核表达载体中 .结论：成功获得反义 pcDNA3.0/cortactin 重组质粒 【. 关 键词】基因表达；高转移肝癌细胞 MHCC97；逆转录聚合酶链反应；人 皮层肌动蛋白 cortactin0 引言原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一 ,其侵袭转移和术后复 发是患者死亡的主要原因 .目前国内外对肝癌转移机制研究逐步深入 . 最近人们发现人皮层肌动蛋白 cortactin 基因对于肿癌的转移有重要的 促进作用.为此，我们利用反义核酸技术构建真核表达载体 pcDNA3.0/cortactin，为后续的研究将该基因片段转染入肝癌细胞株， 观察

7、该基因在肝癌细胞株中的表达情况，并对转染后的细胞功能进行 研究作好准备 .1 材料和方法1.1 材料高转移肝癌细胞 MHCC97购自上海复旦大学中山医院肝癌研究 所；大肠杆菌 Ecoli.Dh5 ，真核表达载体 pcDNA3.0 由第四军医大学分子生物学教研室吴元明博士惠赠 .高糖型 DMEM培养液为 Invitrogen 公 司产品；新生牛血清系北京元亨圣马生物技术研究所产品；胎牛血清 为杭州四季青生物工程材料技术有限公司产品； 胰蛋白酶 (Trypsin)为北 京原平皓生物技术有限公司产品；胰蛋白胨(Tryptone)及酵母提取液(YeastExtrac)t 为 OXLID公司产品；琼脂(

8、Agar)为 Sanland 公司产品； 琼脂糖( Agarose)为上海 Yito 公司产品； Trizol试剂、 Taq酶、 T4DNA 连接酶、限制性内切酶(XhoI,BamHI)、pMD18T 载体、Trizol试剂为 Takana 公司产品；胶回收试剂盒为 BioDev公司产品；质粒小量抽提试剂盒为 Vgene公司.PCR引物：根据 GeneBank中查到的 cortactin 的 mRNA序列， 用软件 PrimerPremier5.0设计上下游引物， 引物序列如下 (划线部分分 别是 BamHI 和 XhoI 的碱基识别序列，斜体部分为保护序列) ：上游引 物 5 ATACTCG

9、AGGTGGAACAAGACCGAATGG；A3下 游 引 物 5 TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACA.1T.T23方法 1.2.1高转移肝癌细胞 MHCC97培养将购回的细胞经 2.5g/L 胰蛋白酶消 化传代，培养于含 100mL/L胎牛血清的高糖型 DMEM 完全培养液中， 置于 37含 50mL/LCO2的孵箱中培养，每 3d 换液 1次，直至铺满 .1.2.2 总 RNA的提取用 2.5g/L 胰蛋白酶消化培养铺满的肝癌细胞 MHCC97， PBS洗涤后转移至 1.5mL微量离心管中，离心 1000g 离心 10min，弃上 清，加入 1mLTrizol试剂，立即反

10、复抽吸至细胞充分裂解，静置 5min ， 加入 200L氯仿剧烈振荡 15s，低温离心机 4 12000g 离心 20min，取 水相至一新的微量离心管中，加入等体积的异丙醇， 4静置 60min， 低温离心机 412000g离心 20min，弃上清， 750mL/L 乙醇洗涤沉淀 2 次、 45000g 离心 10min，弃上清，沉淀自然干燥 3min，加入 15L 无 Rnase 水溶解沉淀 .取 5L行凝胶电泳； 2L用于反转录 .1.2.3 反转录 合成 cDNA根据反转录试剂盒的说明用随机六聚体法反转录合成 cDNA. 将反应体系置于冰上，取总 RNA2L+引物（随机六聚体 ）1 L

11、去+ 离子水 9L于 PCR反应管中，轻轻混匀，在 PCR反应仪中 70静置 5min；放 置冰上，依次加 5Buffer4 L,Rna抑se制剂 1L和 dNTP2L，轻混匀， 25 5min；立即冰浴后加入反转录酶 1（L终体积 20L），轻混匀后依 次进行 2510min,42 60min,7010min 和立即冰浴 .取 cDNA 进行 PCR.1.2.4PCR扩增目的片段 cortactin 基因在 PCR反应管中建立 50L反 应体系： Buffer5 L,MgCl23 L,Sense2.5 L,Antisense2.5 L,cDNA4 L,dNTP2 L,d O31L；并用 50L矿物油封 .热启动 94,4min 后加 Taq酶 0.5 反L.应条 件为： 94预变性 4min 后，95变性 30s，56退火 2min，72延伸 2min，共 35 个循环， 72再延伸 7min. 最后 4保存 .产物行凝胶电泳 . 目的片段切胶按胶回收试剂盒说明行胶回收纯化 .-70保存 .1.2.5 目的 片段与 T载体连接在 0.5mLPCR反