结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建讲解

1、结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建摘要：目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌 H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟 蛋白的编码基因，用限制性内切酶消化后,插入克隆载体pUC19中。经酶切鉴定 与序列测定证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3的相应酶切位点。结果结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实，与 Erdman株完全一致；用EcoRI和Hind川双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入 载体pcDNA3结论以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建 成功，为

2、进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。关键词：结核分枝杆菌；Ag85B真核表达载体 中号：R378.91 + 1,Q782 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)02-314-03Cloning of Ag85B gene of Mycobacterium tuberculosis and itscon structi on of eukaryotic expressi on vectorFAN Xio ng-li n,XU Zhi-kai,BAI Gua ng-chu n,LI Yua n,LI Bie-hu,XUE Ying(Departme nt of Micro

3、biology,Fourth Military Medical Un iversity,Xia n710033,Shaa nxi Provi nce,Chi na)Abstract:Aim To con struct polynu cleotide vacc ine based on Ag85B gene of Mycobacterium tuberculosis.Methods The gene en cod ing Ag85B mature protein was amplified by polymerase cha in reacti on (PCR) from genome of M

4、ycobacterium tuberculosis H37Ra strai n,and in serted in to clo ning vector pUC19 after restrictio n endonu clease digesti on.Gene fragme nt en cod ing Ag85B mature protein was correctly in serted into the vector,which was con firmed by partial nu cleotide seque ncing and restrict ion endonu clease

5、digesti on,and the n was subcl oned to Corresp onding sites cut with Hi nd 川 plus EcoR I of eukaryotic expressi on vector pcDNA3.Results The gene en codi ng Ag85B mature form of Mycobacterium tuberculosis H37Ra strain is ide ntical with that of Erdma n stra in. The cloned gene was correctly in serte

6、d into the vector pcDNA3,which was con firmed by restrictio n endonu clease digestio n.Con clusio n The successful con struct ion of recomb inanteukaryotic expression vector based on the gene encoding Ag85B mature protein of Mycobacterium tuberculosis,lays the foundation for further researching prev

7、ention and treatment of tuberculosis. Keywords:Mycobacterium tuberculosis;Ag85B;eukaryotic expression vector结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。目前 , 全世界仍约有 1/3 的人 感染，每年约 800 万的新发病例和 300 万的患者死亡，加之多重耐药株的出现 和HIV双重感染的威胁，1993年,WHO宣布：全球处于结核病威胁的紧急状态。 卡介苗接种是预防结核病的重要措施，但其预防效果不稳定，接种BCG寸人群的保护率介于0%80%之间。为此，我们克隆了编码结核杆菌分泌蛋白 Ag85

8、B的基因，并构建了该基因的真核表达载体，以期用于结核病的防治研 究。1 材料和方法1.1材料 TaqDNA聚合酶、dNTPs T4DNA连接酶、Hi nd川和EcoR I购自 Promega公司。7H9液体培养基购自 Difco公司。入DNA/HindM + EcoRI购自华 美公司。玻璃奶回收试剂盒购自原平皓公司。其余试剂均为国产分析纯。 E.coliJM10 9,质粒pUC19及真核表达质粒pcDNA3均为本室保存。结核杆菌 H37Ra株为陕西省结核病防治研究所惠赠，保存于7H9液体培养基中。1.2 方法1.2.1结核杆菌基因组DNA勺提取取少量结核菌液接种于7H9液体培养 基中，37C培

9、养2wk。取5mL液体培养物以10000r/min离心10min。将沉淀重 悬于50卩L裂解液（10X PCF缓冲液5卩L，45g/L吐温-205卩L，45g/LNP- 405卩L，20g/L蛋白酶K0.5卩L及水34.5卩L）中，于55C水浴1h,沸水浴 10min灭活蛋白酶K,再以8000r/min离心1min。取上清，用酚/氯仿抽提，无 水乙醇沉淀，溶于50卩LTE中，贮存于-20C备用。1.2.2Ag85B基因的扩增、克隆及测序PCF反应：根据结核杆菌Erdman株 Ag85B基因的全序列2设计引物,P1 : 5 -GCAAGCTTATGACCGCGGG- CGCGTTCTCC-，含

10、HindIII 酶切位点和起始码 ATG P2: 5- GGAATTCTCAGCCGGCGCCTAAC含-EcoRI酶切位点和终止码，由西安美联公 司合成。PCR反应体系为：10X buffer5 卩 L，dNTPs2 L（2.5mmol/L）， DNA牟L,P1和P2引物各1卩L（25卩mol/L）及Taq酶0.2卩L（1U），加水至 50 卩 L。反应条件为：95E 变性 5min，94E 30s,60 C 30s,72 C 50s,共 30 个循 环，再72C延伸5min。扩增产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。质粒的 提取、酶切及克隆参见文献3的方法。即用碱裂解法提取质粒 pUC

11、19后，将其 与PCR产物分别用Hind川和EcoRI双酶切，经1%g/L琼脂糖凝胶电泳，切下 目标条带，参照玻璃奶试剂盒中的说明书回收，各溶于20卩LHO中。取双酶切的PCR产物和质粒pUC19按3 ：1的分子比混合，用T4连接酶连接，转化用 低温CaCl2制备的E.coliJM10 9感受态细胞。然后，涂布于LB平板（含氨苄青霉 素100mg/L），以蓝白法筛选阳性克隆。重组质粒的酶切鉴定和插入片段序 列的分析：随机挑选6个白色菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液 中，37C振荡培养过夜，以碱裂解法提取质粒 DNA将提取的质粒DNA用 EcoRI和Hind川双酶切，进行1 %琼脂

12、糖凝胶电泳，以 入DNA/HindM + EcoRI 为分子量参照，观察有无约880bp大小的片段。将筛选出的阳性克隆采用 San ger双脱氧链终止法，在ABIPRISMT测序仪上进行双向测序。1.2.3Ag85B基因真核表达载体的构建将碱裂解法提取的阳性克隆重组质粒DNA用EcoRI和Hind川双酶切后，进行1 %琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶回 收约880bp大小的酶切产物，并与用相同酶切回收的pcDNA3质粒载体DNA连接，转化E.coliJM10 9感受态细胞。所获阳性克隆用 Hind川和EcoRI双酶切鉴2结果2.1Ag85B基因的扩增、克隆及序列分析以结核杆菌基因组DNA为模板，采用P

13、1和P2引物进行PCR经30个循环后，扩增出约880bp大小的特异性条 带（1）。将扩增产物酶切后，与质粒 pUC19连接并转化感受态JM10。随机挑 选6个白色菌落提取质粒，经 Hind川和EcoRI双酶切后，有5个克隆切出约 880bp大小的片段，即阳性克隆（2）。将2号阳性克隆命名为pUC19-TB30经 正、反向自动测序，所得序列结果与文献2报道的一致（3）0同时证实，结核杆菌H37Ra株和Erdman株的Ag85B成熟蛋白编码序列相同。该段基因的序列 已被收录入 GenBank（AF198032。1PCFT增产物的琼脂糖凝胶电泳Fig1 Agarose gel electrophor

14、esis of PCR productM:Marker 入 DNA/Hind IH + EcoRI ;1:PCR product.2重组质粒pUC19-TB30勺酶切分析Fig2 Restrictio n en zyme an alysis of the recomb inant plasmidpUC19-TB30M:Marker 入 DNA/Hind IH + EcoRI ;1 6:Plasmid pUC19 cut with EcoRI and Hind III;7:Uncut plasmid pUC19.2.2结核杆菌真核表达载体的构建将2号阳性克隆扩大培养，以碱裂解法提取质粒DNA用H

15、ind川和EcoRI双酶切，玻璃奶回收约 880bp大小的酶切 产物，与用同样酶切的pcDNA3质粒载体连接，并转化JM109感受态细菌。转化 后，在选择平板上随机挑选5个克隆，提取质粒，用Hind川和EcoRI双酶切 后，全部切出约880bp大小的片段。3插入片段的核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig3 Nucleotide and deduced amino acid seque nces of the inserted fragme nt3 讨论机体抗御结核菌的感染主要依靠细胞免疫。能诱发保护性细胞免疫应答结 核杆菌蛋白存在于该菌对数生长早期的培养物中。Ag85B为结核杆菌主要分泌蛋白Ag

16、85复合体（包括Ag85A B和C,相对分子质量（Mr）介于30000 32000）中的组分之一 4。目前，已知该复合体属于分枝菌酸转移酶，在结核 杆菌细胞壁合成的晚期起关键作用 5。在结核杆菌众多的分泌蛋白中， Ag85B （Mr为30000蛋白）可诱导实验动物产生 Th1型细胞免疫应答，其抵抗结核杆 菌再感染的能力优于BCG6,7。Ag85B还可诱导PP邙日性健康人群外周血单个核 细胞分泌高水平的IFN- 丫，而活动期肺结核患者的外周血单个核细胞分泌IFN-丫的水平极低，也进一步表明 Ag85B是机体的保护性靶抗原8。从已有的研究 表明，Ag85B可能是最有希望取代BCG的亚单位疫苗。基因

17、疫苗是疫苗研制的 第3次革命，其制备简单，可诱导持久的体液和细胞免疫应答，特别是可诱导 产生CD补CTL而亚单位疫苗则不易达到9。我们通过克隆结核杆菌分泌蛋白 Ag85B的编码基因，并构建了其真核表达载体，从而为进一步研究该表达载体 作为核酸疫苗在结核病防治中的作用奠定了基础。西安 710032)西安 710032)西安 710032)作者简介：范雄林，男， 27 岁，博士生 范雄林 （第四军医大学微生物学教研室，陕西 徐志凯 （第四军医大学微生物学教研室，陕西 白光春 （ 第四军医大学微生物学教研室，陕西李元（第四军医大学微生物学教研室，陕西西安 710032）李别虎（第四军医大学微生物学教

18、研室，陕西 西安 710032） 薛莹（第四军医大学微生物学教研室，陕西西安 710032）参考文献 :1 Fine PEM.Variation in protection by BCG:implications of and for heterologous immunity J.Lancet,1995;346:1339-1345.2 Harth G,Lee BY,Horwitz MA.High level heterologous expression andsecretion in rapidly growing nonpathogenic mycobacteria of four ma

19、jor Mycobacterium tuberculosis extracellular proteins considered to be leading vaccine candidates and drug targets J . I nfectImmun,1997;65(6):2321-2328. 3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual M .2nd ed,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:133-148.4Wike

20、r HG,Harboe M.The antigen 85 complex:a major secretion product of Mycobacterium tuberculosisJ.MicrobiolRev,1992;56(4):648-661. 5 Belisle JT,Vissa VD,Sievert T,et al.Role of the major antigen of Mycobacterium tuberculosis in cell wall biogenesis J.Science,1997;276:1420-1422. 6 Ho rwitz MZ,Lee BW,Dillon BJ,et al.Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with maj