感受态细胞制备及各种感受态的特点

1、2 感受态细胞制备 制备感受态常用的方法是电击法和CaCI制备法，以下介绍 CaCI制备法：22I、可以从-80 C冰柜 中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗 平板（由于 Rocetta 含有氯霉素抗性， 需要涂布在氯霉素抗性的平板， 后面的都是如此 ）上划线， 并将菌种迅速放回-80 C保存，在划线板上做好相应标记，于37 C培养过夜。 2mIEP 管中，37 C, 220rpm 震荡 2、从37 C培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于 培养约 6 个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以 1:100 的比例接种于 50mI LB 液体培养基

2、 瓶）中,37 C振荡培养 2.5小时至OD600=0.5 注意：接种比例不得大于 1:10 。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50mI ）中，在冰上放置 510min ； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要 严格按照无菌操作。 4C 5000g 离心 5 分钟； 4、4C 5000g 离心 5 分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀， Note ：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入 2mI 预冷的 0.05moI/L CaCI - 1 5%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟， 4C5000g2 离心 5 分钟； 6 、

3、沉淀加入 2mI 预冷的 0.05moI/L CaCI - 1 5%甘油混合溶液， 轻吹散，即成为感受态细胞 2悬液。 分装成50100卩I的小份，贮存于-70 C可保存半年。 含 15% 甘油的 0.05moI/L CaCI 制备方法 : 2称取 0.28g CaCI（ 无水,分析纯 ）,溶于 50mI 重蒸水中 ,加入 15mI 甘油,定容至 100mI, 高压灭 2菌。 感受态细胞的特征 感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源 DNA 的状态。感受态细胞的特征： （1 ）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA 的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位 点充分暴露） 。（2）细胞膜通透

4、性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA 直接穿过 质膜进入细胞） 。（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA 分子不 易被切除或破坏。 实验室常用的感受态细胞 a菌株1.DH5在克隆菌株：a E.COli DH5DH5 a是一种常用于质粒克隆和高拷贝质粒的稳定复 制的菌株。半乳糖苷80IacZ M15基因产物可与载体编码的使用pUC系列质粒载体转化 时，其的突变有利于和end A1 互补，酶氨基端实现a可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。Rec A1 DNA的提取。克隆 DNA的稳定和高纯度质粒 -，、endA1、hsdR17（rk基因型：F $ 80dIacZ M

5、15、 （lacZYA -argF）U169、deoR、recA1 -+reIA1 、thi-1、mk）、phoA、supE44、入 gyrA96、 菌株 2.TOP10 ：该菌株适用于高效的 DNA 克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 克隆菌株-、recA1、-hsd RMS -mcrBC）、$ 80 lacZ M15、 lac X 74、基因型：F、mcrA （mrrnupG galK、galU、rps、（Strr） endA1、ara 139 （ara -leu）7697 菌株：3.BL21（DE3） 系列）启动子的表达载体 蛋白表达菌株：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7

6、 （如pET噬 菌的基因。该菌株用于 T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7 的聚合 酶基因的表达受控于入噬菌体DE3区的BL21acUV5 启动子，该区整合于体RNA染色体上 该菌株适合于非毒性蛋白的表达。 - ）dcm（DE3 基因型： F、ompT 、 hsdS （ rm 、）、gal BB 菌 株 4.BL21（DE3） pLysS 溶菌酶含有表达 T7PLysS 蛋白表达菌株 ：该菌株含有质粒 pLysS ，因此 具有氯霉素抗性 。该菌适合表达毒性能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表 达。的基因， 蛋白和非毒性蛋白。 -Camr 、）（DE3

7、 、pLysS hsdS 基因型： F、ompT 、（ rm ）、 gal 、dcm BB 5.Rocetta 感受态特征： 蛋白表达菌株 系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆 菌中稀少的 Rosetta 系列菌株来源于 BL21 真核细胞密码子， 增加了真核细胞的蛋白表达水平。 Rocetta （DE3 ） （ 1 ）、AGGAUA 该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏 的 6 种稀有密码子（菌株提供了“万能”的翻译，从Rocetta ，这样）对应的 、 AGACUACCCGGA tRNA 而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制，提高外源基因尤 其是真核基因在原核系 2

8、 / 4 基因由它们的天然启动子驱动。统中的表达水平。tRNAB -B - ， m ）、gal、dcm、lacY1（DE3） 、， argWpRARE（argUhsdSB （r 基因型： F、 ompT 、 pro L）（Cmr ） ileX， glyTleuW ,，补充：稀有密码子对蛋白表达的影响：数氨基酸都有一个以上的密码子，E.coii密码子应用情况分析表明一些密码子很少使用 对和脯氨酸尤其是精氨酸密码子 AGA , AGG , CGG , CGA异亮氨酸的密码子 GGA;亮氨酸的密码子CUA和甘氨酸的密码子AUA当在氨基端的密码子目的基因 中含有过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生

9、不完全产物的一个原因。CCC很少被用到。 的高频出现可能大大影响蛋白附近出现多个稀有密码子的时候，情况更为严重，许多研究表明，精氨酸的密码子AGA AGG和 的产量。当这些密码子出现在 N-端附近时候，这种影响将达到最大。菌株可以增 多个实验室报道，在宿主菌中增加同类 tRNARosettaTM时那些含有稀有密码子基因的蛋白产量将大大 提高。加精氨酸稀有密码子 AGG和AGA,CCCGGA和脯氨酸的密码子AUA;亮氨酸的密码子CUA和甘氨酸的密码子异亮氨酸的密码子.稀有密码子基因的目 的蛋白很适合用于表达那些含 E.coli 因此, http:/ ）（引用自网址 质粒，除了能够，本菌株含有 p

10、RARE2 ）Rosetta 2 （DE3） pLySs 来源于 Rosetta（DE3） （2六个 稀有密码子的和 GGA 提供原 Rosetta（DE3） 宿主菌含有 AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 质粒具有氯霉素抗 pRARE2 。同时， CGG 的 tRNAtRNA 外， 还提供了第七个稀有密码子载体通 过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌，Rosetta2（DE3）pLySs 性。所 DE3 是 溶源性的入DE3,能够提供更加“通用”的蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。启动子系 系列载体，及其他 T7pET 以带有 T7 RNA 聚合酶的染色体拷贝。

11、该菌株适用于溶菌酶，可以有 效降低目的基因的基础质粒能够产生 T7pLySs 列载体。含有 pLSs 质粒， p15 Origin, 质粒的起 始复制位点是 pLySs 表达水平。 pLySs 质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。 pBR322 -衍生的质粒 互相共存。这使得该质粒能够和pUC-及 转化C, 42转化的原理：溶液中的Ca离子和细菌 细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在 1 、 90s 进入细菌细胞中。热激下，这种液晶结构收 缩，将细胞膜扯开孔道，使 DNA 、 转化的步骤： 2）取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将 刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管（ 1 中，置于冰浴中。 （2

12、） 向感受态细胞中加入目 的 DNA（50ul 感受态细胞能够被 1ng 超螺旋 DNA 所饱和）， 3 / 4 ；轻弹混匀， 在冰浴中静置 30min体积不能超过感受态细胞悬液体 dna50ui，可以根据实际情况分装使用，应注意所用一次转化感受 态细胞的建议用量为注意：连接10ul，会影响转化效率，体积不能超过10ul，所以连接时做积的十分之一，也有说法是不能超过 5%。不能加入太多DNA 4 体系可用一半做转化，剩下的放在c。（一使细胞冷却 2-3min ,）将离心管置于 42度水浴中放置 90s然后快速 转移到冰浴中，（3;）般2min，该过程不要摇动离心管 度摇床培养基（不含抗生素）无菌的LB， 混匀后置于 37）向每个离心管中加入（ 4500ul ，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使 菌体复苏。150rpm震荡培养45min （），也可据情况而定）转化产物）将离心管内容物混匀， 可吸取适量（可吸取 200-300ul5 （）后，吸掉部分上清， ， 2min 涂布平板，而如果预计的克隆 较少，可通过离心（ 4000rpm 悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。 4