纯化的小熊猫重组IFN

1、纯化的小熊猫重组IFNγ干扰素(IFN-γ)由NK细胞、活化的Th1和细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTL)等细胞产生。IFN-γ的免疫学活性主要表现在如下几个方面:促进NK细胞活性;增强巨噬细胞递呈抗原及其杀菌功能;诱导活化的B细胞产生IgG2a和IgG3;通过上调转录因子T-bet表达促进Th1的分化;通过抑制Th2分化,促进CTL活化,激活巨噬细胞等途径极化机体的细胞免疫功能;提高MHC类分子在抗原递呈细胞表面的表达量;直接抑制病毒复制效应。因此,IFN-γ是天然免疫和适应性免疫应答过程中很重要的细胞因子之一,在机体抗

2、细胞内寄生菌、抗病毒以及抗肿瘤中发挥着关键作用。基于此,人工制备重组IFN-γ并将其应用于动物传染病和肿瘤治疗,已经在兽医临床取得了较好的效果。人工舍饲养殖小熊猫过程中,因细菌、病毒和寄生虫等感染引起的小熊猫死亡问题一直令人感到棘手,至今未有较为合理有效的应对措施。本研究以纯化的小熊猫重组IFN-γ为材料,对其免疫活性进行鉴定,为小熊猫传染病及肿瘤的预防和治疗提供新的手段。1、材料与方法1.1材料1.1.1试验用动物成年健康小熊猫6只(2只雌性,4只雄性),饲养于海峡(福州)大熊猫研究交流中心。1.1.2主要试剂淋巴细胞分离液为上海华精生物高科技有限公司产品;ConA、

3、Hepes、L-Gln、MTT和丙酮酸钠为Sigma公司产品;RPMI-1640培养基为Hyclone公司产品;犊牛血清为Gibco公司产品;β-巯基乙醇,DMSO为Amresco公司产品;青、链霉素,肝素锂抗凝管,小熊猫IFN-γ原核表达蛋白(纯化后冻干),NaHCO3,NaCl,KCl,Na2HPO4·12H2O,KH2PO4均为进口或国产分析纯;辣根过氧化物酶标二抗(羊抗兔IgG-HRP),碳酸盐缓冲液,洗涤缓冲液(PBST),封闭液(含50g/L脱脂奶粉的PBST),终止液(2mol/L的H2SO4),96孔酶标板。1.1.3主要仪器水平转子离心机,

4、角转子离心机(eppendorf),超净工作台,酶标仪(BIO-RAD),CO2培养箱(Thermo),恒温培养箱,普通光学显微镜,普通冰箱,-70超低温冰箱。1.2方法1.2.1小熊猫外周血单个核细胞悬液的制备前肢静脉无菌采小熊猫外周血3mL,肝素抗凝。将抗凝血沿离心管壁缓慢叠加到3mL淋巴细胞分离液上,注意尽量不要让血液与淋巴细胞分离液的分界面晃动。2000r/min离心20min。吸取云雾层细胞到另一干净离心管中,加入两倍体积的PBS(含20mL/L犊牛血清),温和颠倒混匀,1000r/min×10min洗涤细胞,弃上清。重复洗涤细胞2次。最后一次洗涤结束后,弃掉上清,利用台

5、盼蓝染色法染色,3min内计数,活细胞数目要求在95%以上。用完全1640培养基将细胞密度调整为1×107个/mL。1.2.2淋巴细胞增殖试验吸取100μL细胞悬液加入到96孔培养板中,试验组加入100μL不同浓度(100×1.56、10-1×1.56、10-2×1.56、10-3×1.56、10-4×1.56、10-5×1.56mg/mL)的小熊猫IFN-γ原核表达蛋白或经热变性处理(煮沸10min)的小熊猫IFN-γ原核表达蛋白(10-1×1.56mg/mL)

6、。对照组加入100μL的完全1640培养液。37、体积分数为5%CO2培养箱中培养72h。细胞培养至68h时,每孔无菌吸取50μL上清弃掉,加入15μLMTT。37、体积分数为5%的CO2培养箱中继续孵育4h。细胞培养72h时,每孔吸取100μL上清弃掉,加入100μLDMSO彻底裂解细胞,用酶标仪在490nm波长处测OD值,计算SI值,确定出最佳刺激效果的稀释梯度。1.2.3PBMC培养上清的制备分离小熊猫外周血单个核细胞(periphalbloodmononuclearcells,PBMC),步骤同1.2.1,用完全1640培养基将细胞密度调整为1×

7、;107/mL。吸取500μL细胞悬液加入到24孔培养板中,再加入500μL浓度为10-1×1.56mg/mL的小熊猫IFN-γ原核表达蛋白溶液,另设PBMC阴性对照。37、体积分数为5%CO2培养。分别在刺激后12、24、36、48、60、72h收取细胞上清,置-80保存,供IFN-γ测定使用。1.2.4IFN-γ的间接ELISA测定1.2.4.1抗原包被不同时间收集的PBMCs培养上清冻干粉,用等量的碳酸盐缓冲液(pH9.6)溶解,然后以100μL/孔包被,另设相应的对照孔。4过夜,弃去包被液,用PBST洗5次。1.2.4.

8、2封闭每孔加入100μL含50g/L脱脂奶粉的PBST,37,孵育1h。弃去封闭液,PBST洗涤5次。1.2.4.3加一抗用PBST将兔抗IFN-γ血清稀释1000倍,每孔加入100μL,37,孵育1h。弃去孔中液体,PBST洗涤5次。1.2.4.4加二抗羊抗兔IgG-HRP用PBST稀释成15000,每孔加入100μL,37孵育50min。弃去孔中液体,PBST洗涤5次。1.2.4.5每孔加入100μL的底物显色液,37孵育15min。1.2.4.6终止加入2mol/L的H2SO4终止反应,测OD450nm值。2、结果2.1重组IFN-γ对小熊

9、猫PBMC增殖的影响本研究结果显示,浓度组为10-1×1.56mg/mL、10-2×1.56mg/mL的小熊猫IFN-γ原核表达产物与小熊猫外周血T淋巴细胞共孵育后,具有显著刺激T淋巴细胞增殖的效应(P我们对IFN-γ原核表达产物进行了蛋白热变性处理,结果发现浓度为10-1×1.56mg/mL的IFN-γ经热变性处理后,与空白对照组相比,其淋巴细胞增殖效果无显著差异(P0.05),但与未经热变性处理组相比,淋巴细胞增殖效果显著降低(P2.2重组IFN-γ对小熊猫PBMC分泌IFN-γ的影响本试验测定

10、了PBMC在重组IFN-γ作用下,不同时间点培养上清中IFN-γ的水平。结果显示,与对照组相比,试验组IFN-γ含量在60h之前均显著升高(P0.05)。结果表明,IFN-γ原核表达产物具有刺激小熊猫外周血淋巴细胞分泌IFN-γ活性。PBMC培养系统加入的重组IFN-γ在短期内(24h)迅速激活Th1和CTL细胞并分泌IFN-γ,之后随着培养时间延长,效应T细胞活力下降,其分泌能力随之下降并停止。加之IFN-γ则在酸性环境不稳定,故而累积在上清中的IFN-γ则随时间延长而不断衰减,导致培

11、养后期培养上清中IFN-γ水平下降(图3)。3、讨论外周血单个核细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞以及单核细胞,经过淋巴细胞分离液分离后获得的PBMC主要包括T、B淋巴细胞和极少量的NK细胞。T细胞由Th1、Th2、CTL、Th17等组成,其中Th1、CTL等T细胞的活化分化均需要IFN-γ。换言之,IFN-γ在细胞培养水平具有刺激T细胞增殖的效应,并且这种作用在一定范围内呈量效正相关的关系。活化以及效应Th1和CTL又具有分泌IFN-γ活性,在其培养上清中又可以检测到IFN-γ,并且上清中IFN-γ水平的高低与活化以及效应

12、Th1和CTL数量紧密相关。基于上述免疫学原理,本研究采用PBMC增殖试验和间接ELISA,分别测定了重组IFN-γ刺激小熊猫PBMC增殖及其培养上清中IFN-γ含量,以此判定小熊猫原核重组IFN-γ的免疫活性。本研究在IFN-γ活性时之所以不选择动物个体水平试验,基于两个原因:小熊猫属于国家珍稀保护动物,数量有限;正常小熊猫个体使用重组IFN-γ效果未必明显,病毒感染或荷瘤小熊猫样本短时间内难以获得。此外,也有研究采用IFN-γ直接抗病毒增殖的特点,通过测定其在细胞培养水平抑制病毒增殖效果来评估的活性。作为免疫活性细胞因

13、子,其更重要更明显的活性是体现在其免疫学方面,这也是本研究不测定重组IFN-γ抗病毒增殖活性的原因。本研究结果表明,纯化的小熊猫重组IFN-γ具有较好的免疫活性,能够刺激小熊猫T淋巴细胞增殖及促进其分泌IFN-γ。从培养上清中IFN-γ含量分析,在12h时含量就已经明显升高,提示在这个时间点产生细胞已经充分活化。换言之,我们在培养系统中加入的重组在12h之前就已经发挥了其刺激T细胞增殖的作用,这和我们前期预试验在12h就可以观察到PBMC有细胞大量增殖形成的克隆团现象刚好吻合。由于一般的蛋白质抗原在PB-MC细胞培养系统中刺激淋巴细胞增殖形成克隆

14、团现象通常需要24h,因此,本研究结果充分表明,我们制备的小熊猫重组IFN-γ具有很好的免疫活性。为进一步证实这一结论,我们对小熊猫重组IFN-γ按照蛋白质热热变性条件进行处理,再将热变性的重组IFN-γ加入到PBMC培养系统中,结果显示其刺激细胞增殖的活性消失。表明重组IFN-γ活性的发挥需要特定空间构象的维持,这与天然IFN-γ活性需要特定构象的特性相一致。本研究结果证明,一旦该重组细胞因子的空间构象被破坏,其免疫活性也就随之丧失。这一结论为下一步制备供小熊猫临床应用的重组IFN-γ提供了极有参考价值的依据。人类IFN-&gamma