凉燥致病机制探究论文

1、凉燥致病机制探究论文【摘要】目的研究凉燥对小鼠的主要致病机制。方法216只无特定病原体级（SPF）昆明小鼠随机分为常温常湿组（A组），常温燥组（B组），凉燥组（C组），每组72只。在模拟凉燥条件下造模，第7天与第14天检测气道与皮肤组织病理、气管纤毛运动、气道液分泌（RS）与气道液IgG抗体（IgGR）、血液流变学、细菌攻击实验与气管细胞bcl-2基因、bax基因表达。结果与A组相比，C组第14天气管、肺与皮肤病变明显，肺细菌数增高，IgGR增高，第7天RS降低（P 【关键词】凉燥致病机制 Abstract：ObjectiveToinvestigatethepathogeniceffectso

2、fCool-Dryonmice.Methods216Kunmingmice(SPF)weredividedintothreegroupsincludinggroupA(normalmice),groupB(normaltemperatureandOuterDrymice),groupC(Cool-Drymice),72mice/group.RespiratorysecretionofMucopolysacchride(RS),IgGofRespiratory(IgGR)，hemorrheology，BacterialattackingandExpressionofbcl2，baxgenewer

3、etestedinday7and14.ResultsIngroupCthepathologrealchangesofrespiratoryandskinswereobvious,andbacilliaquantityoflungincreased,bcl2geneexpressionwasreducedsignificantlycomparedwithgroupA(P Keywords：Cool-Dry;Pathogenicmechanism 燥气清冷肃降，肃杀收引，“燥气先伤于华盖”，易伤津液。“秋深初凉，西风肃杀，感之者，多病风燥，此属燥凉，较严冬风寒为轻。”外燥有温燥与凉燥之分，但未见凉

4、燥病机系统性实验研究报道。在相关研究中证实外燥致小鼠气道病变的基础上1，本文研究凉燥及相兼细菌攻击对小鼠气管纤毛运动、气道液分泌与气道液IgG抗体、血液流变学及气管细胞bcl2基因，bax基因表达等影响，为阐析凉燥致病机制提供资料。 1材料与方法 1.1动物 无特定病原体级（SPF）昆明种小鼠216只，体重（181）g，雌雄各半，湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-2005。 1.2仪器与试剂 LRH250人工智能气候箱（温度：（30651），相对湿度：（3090）%5%，广东医疗器械厂），XSJD恒温倒置显微镜（重庆显微镜厂），CS501超级恒温器（重庆实验仪器厂）

5、，756MC紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），FASCO全自动血液流变仪（重庆南方医疗设备公司）。咔唑（批号：054K078，Sigma公司），D-葡萄糖醛酸内酯（批号：2711EC，Sigma公司），四硼酸钠与台氏液试剂、10%甲醛、HE染料（分析纯，批号：050108）上海精细化工科技有限公司。TUNEL试剂盒（MK1020，200503）、bcl2兔抗鼠IgG多抗（BA0412，200503）、bax兔抗鼠IgG多抗（BA0315，200503）和阳性对照片由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1.3菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC25923，北京天坛生物制品公司)。 1.

6、4方法 1.4.1动物模型及分组 216只昆明小鼠随机分为常温常湿组、常温燥组、凉燥组，每组72只，分批置人工气候箱内、用昆明种小鼠饲料常规饲养。按表1模拟外燥“温度相对湿度风”条件进行造模。各组第7天和第14天进行检测前4h禁食、禁水。表1各组小鼠“温度相对湿度风”处理条件（略） 1.4.2病理组织学观察 断颈处死小鼠，常规取气管1.5cm，右肺组织（中）（4010）mg/只、背部皮肤（0.5cm0.5cm）及左足垫皮肤，HE染色、镜检。 1.4.3气管上皮纤毛运动实验（CiliamovementofTrachealEpithelium,CM,min/mm）：按文献方法2。 1.4.4气道液

7、黏多糖（RespiratorysecretionofMucopolysacchride,RS,g/ml）测定：咔唑比色法，参考文献方法2。 1.4.5气道液IgG（IgG-R）检测 常规气管插管，取灌洗液分离上清，按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明书检测。以包被液作空白对照，PBSpH7.4（10%小牛血清）作阴性对照。每份样品检测3次，记录标本均值与阴性对照（P/N）倍数之平均值。 1.4.6血液流变学检测3 受血液流变仪对血量标本的限制，每组取9只小鼠眼球血合为1份标本进行测试，3份/组。肝素抗凝管取眼球血，4h内测定血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数。 1.4.7细菌攻击实

8、验 取培养18h金黄色葡萄球菌，经标准比浊法配成细菌悬液（1108cfu/ml），各组小鼠于第7天经鼻常规滴种金黄色葡萄球菌0.1ml/只，24h后重复1次。接种细菌第6天无菌取小鼠右肺（4010）mg/只常规检测肺细菌数（BacilliaQuantity,BQ，1106cfu/g取均值），以及RS与IgGR4。 1.4.8气管细胞凋亡检测 第14天取气管切片，按脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）试剂盒程序操作。结果判断：气管上皮细胞核内出现棕黄色颗粒为TUNEL染色阳性。镜下随机计数200个细胞，计算： 细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数200100% 1.4.9气管细胞bc

9、l-2基因，bax基因表达检测第14天常规取气管标本切片、按试剂盒说明书操作。结果判断：气管上皮细胞浆内出现棕黄色颗粒为bcl-2（或bax）表达阳性。镜下计数500个细胞，计算： 阳性指数（PI）=阳性细胞数记数细胞数100% 1.4.10统计学处理 实验数据以s表示，采用SPSS13.0软件，资料之间比较用ANOVA分析，显着性检验采用多个样本均数间q检验（Newman-Keuls法）；各组第7天与第14天比较用t检验，P 2结果 2.1气管、肺结构观察常温常湿组第7、第14天气管上皮结构完整、纤毛整齐，气管腺体、细支气管与肺泡未见异常，背部皮肤结构完整，毛球数多，新生毛干数丰富且层次清晰

10、，足垫皮肤汗腺丰富。常温燥组第14天部分气管纤毛倒伏、黏连，肺泡轻度淤血，皮肤未见异常；凉燥组第14天气管上皮鳞状化生，气管纤毛多呈灶状缺损，20%气管浆液腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水肿明显，均较第7天严重；背部皮肤无明显异常，但足垫部皮肤腺体明显减少与皮下结缔组织增生。 2.2凉燥对气管上皮纤毛运动（CM）、气道液黏多糖（RS）与IgGR的影响结果见表2。表2凉燥对小鼠气管纤毛运动、气道液黏多糖与IgG-R的影响(略) 2.3凉燥对小鼠血液流变学的影响见表3。与常温常湿组比较，凉燥组血液流变学指标改变无显著性。表3凉燥对小鼠血液黏度的影响(略) 2.4凉燥相兼细菌攻击对小鼠肺细菌数（BQ）

11、、呼吸道液黏多糖（RS）与IgG-R的影响见表4。表4细菌攻击对凉燥小鼠BQ、RS与IgG-R的影响（略） 2.5凉燥对气管细胞凋亡与bcl-2基因、bax基因表达的影响见表5。表5凉燥对小鼠气管上皮细胞bcl-2、bax基因表达与细胞凋亡的影响(略) 3讨论 按表1条件处理，病理检查可见凉燥组第14天气管上皮鳞状化生与炎性细胞浸润，气管纤毛多呈灶状缺损，肺泡充血、水肿明显，表明凉燥伤肺、伤津，肺失其濡养而致组织细胞结构受损；20%气管浆液腺上皮黏液腺化生，提示与凉燥肺津生成障碍相关；足垫皮肤汗腺明显减少与结缔组织增生等，表明肺宣输失司、皮毛腠理失之濡润，合以卫表不固，致“燥气先伤于华盖”。本

12、结果为凉燥致病提供组织学证据。 气道液内含黏蛋白（主为黏多糖和蛋白质），覆盖于黏膜表面形成黏液毯，是气道的重要保护性屏障之一；RS与气道液分泌呈正相关，其主要作用是湿润气道黏膜、保护上皮的纤毛运动。与常温常湿组比较，凉燥组第7天RS减少，显示凉燥早期气道液分泌严重减少而具“干”之特点。值得注意的是凉燥组第14天RS明显增多（P bcl-2属于低丰度表达基因，编码的bcl-2/bax家族蛋白如bcl-2/bax二聚体为抑制细胞凋亡构型，bax/bax二聚体可诱导细胞凋亡。结果显示，常温常湿组与凉燥组气管细胞凋亡率均较低（0.3%），但凉燥组气管bcl-2阳性细胞多见于气管纤毛缺损或鳞状上皮化生处，提示与凉燥致病机制相关。 结果表明，凉燥主要病机可能是：凉燥伤津，凉燥之邪的凉气可伤肺阳而致肺津不化，凝集成痰饮，合以宣输失司，皮毛腠理失养而致卫表不固；肺津生成锐减，气道“纤毛-黏液毯”生物防御屏障受损，合以对生物病原攻击敏感性增加等综合因素致病。凉燥致气管细胞bcl-2基因表达下调与凉燥致病机制的相关性值得研究。 【参考文献】 1丁建中，张六通，邱幸凡，等.外燥对小鼠气管上皮纤毛运动与呼吸道液分泌的影响J.中医杂志，2006，48（8