细胞周期同步化

1、细胞周期同步化在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂 活动，其余细胞分别处于 G1、S 和 G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会 影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大 量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。 细胞周 期同步化 （synchronization） 是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋 亡，借助某种自然或人为的实验手段 , 使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同 一时相 （ 除了 G0期的细胞 ） 的现象。细胞同步化本质上包括用一定的

2、方法 获得一定数量的 同步化细胞群 和 使细胞进入同步化生长 的两层含义。DNA 合成抑制法 是通过抑制 DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。 高浓度 TdR（胸腺嘧 啶核苷）双阻断法 是目前常用的抑制 DNA 合成的同步化方法。它 可逆地抑制 DNA 合成，而 不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群 阻断在 S 期或 G1 /S 交界处 。其原理是 : Td 是细胞 DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量Td，可形成 过量 的三磷酸腺苷，后者能 反馈抑制 其他核苷酸的磷酸化，从而抑制 DNA 合成。它将细胞同步于 G1 /S 期 交界处， 同步化程度高 ，适用于 任何培养体系

3、，可将几乎所有的细胞同步化，但是 容易产 生非均衡生长，个别细胞体积增大 。 Td 双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面 对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲 、5- 氟脱氧尿嘧啶 、阿糖胞苷 、氨甲蝶呤 和 高浓度 ADR、 GDR也属于 DNA合成抑制剂，它们与 TdR作用相似，均可通过抑制 DNA合成达到同步化的目的。中期阻断法 是利用 破坏微管 的药物将细胞阻断在 M期 从而得到同一时期细胞的方法，常 用的药物有 秋水仙素 等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成， 将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法 非平衡生长问题不 明

4、显 ，但可逆性比较差 ，当 阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂 。过去研究中也发 现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的 S 期细胞旺盛。 秋水仙胺 、 Nocodazole 也是目前常用的中期阻断剂。经过同步化之后的细胞可以通过 流式细胞术 对其周期进行分析 。将细胞用 PI （碘化丙 啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的 DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成G1/G0期( 1倍) ，S期( 1-2倍)和G2/M期( 2倍) 。流式细胞仪可以 根据 DNA含量在不 同时间内的变化 , 从而确

5、定细胞周期的长短 , 也可以直接 标记 DNA复制(放射性同位素标 记) , 统计细胞数量与标记细胞的百分比 , 对细胞周期进行综合分析 .连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周 期(cell cyc1e) 。细胞周期包含四个阶段： G1期 (first gap),又称合成前期，指前一次有丝分裂完成到 DNA复制前的一段时期； S期(synthesis phase),即 DNA合成期，为真核细胞分裂 (cell pision) 间期中进行 DNA合成的阶段； G2期 (second gap), 为 DNA合成 后期，指 DNA合成结束至有丝分裂开始之间的

6、一个阶段；M期 (mitosis or pision) ,又称 D 期，是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期(M期)和分裂间期(即 G1SG2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相 对而言 M期最短， S期较长 。流式细胞仪( flow cytometer ； FCM)的工作原理是在样品管 中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单 细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。然后通过对流动液体中 单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出 其体积、内部结构、 DNA

7、、 RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞 仪不仅可以根据不同时间内 DNA含量的变化来确定细胞周期的长短，还可以直接用放射性 同位素标记 DNA复制，通过统计细胞数目与比较各时相细胞的百分比来检测是否达到预期 目的，从而对细胞周期各时相进行综合分析。流式细胞分析法与传统的荧光镜检查相比， 具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。Hela细胞周期时间为 21 h，其中 G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为 1 h。一、 S期同步化方法 (胸腺嘧啶核苷双阻断法，两次可让细胞同步化到 G1/S期) 胸腺嘧啶核苷 (TdR) 双阻

8、断法：在处于对数生长期细胞的培养基中首次加入过量的DNA合成抑制剂 TdR，能可逆地抑制 S 期细胞的 DNA生成，而不作用其他细胞阶段的运转，导致大 多数细胞群被同步化于 G1/S 期交界处，但仍有部分细胞处于 S期范围；移去胸腺嘧啶核 苷，细胞再培养一段 比 S 期较长而短于 G2、M、G1三期总和的时间 ，让它们完全越过 S 期，但又不使按周期发展最快的细胞进入下一个S 期。第二次胸腺嘧啶核苷处理，当细胞继续运转至 G1/S 交界处时，被过量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。细胞则于 G1/S 期边界汇 集，再次撤掉胸腺嘧啶核苷，加入完全培养基，使细胞继续生长，则细胞同时启动于 S 期。 5-氟

9、脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度AdR和 GdR等 DNA合成抑制 剂均可抑制 DNA合成使细胞同步化，由于 高浓度胸腺嘧啶核苷对 S 期细胞的毒性较小 ，因 此常用胸腺嘧啶核苷双阻断法诱导细胞同步化。其优点是同步化程度高，适用于任何培养 体系。几乎可将 所有的细胞 同步化，缺点是造成 非均衡生长，个别细胞体积增大 。二、 M期 同步化方法（ 振荡收集法 ）该法利用 M期细胞变圆易脱落 的特点。在处于对数增殖期的单层贴壁细胞（分裂活跃， M 期多）中加入 Nocodazole 。一段时间后，多数细胞被阻滞与 M期，轻轻振荡或拍击培养 瓶， M期细胞则与瓶壁脱离，悬浮在培养液中，收

10、集培养液，之后再加入新鲜培养液，按 照此法继续收集，可得到一定数目的M期细胞。振荡收集法操作简单，同步化程度高并且细胞不受药物伤害，能够真实反映细胞周期状况，缺点是由于M期较短，被分离出的 细胞很少 ，只能应用于贴壁细胞 。收集到的有丝分裂期的细胞可以 贮存在冰上 ，然后处理其余 的培养瓶。三 . 实验用品1. 材料： Hela 细胞。2. 试剂： %胰蛋白酶液、无血清细胞培养液、 DAPI试剂、 Hanks 液、 2mmol/L TdR 、70 乙醇（保存于 4）、 RNase-A（ 10mg/ml,-20 保存）、 PI （ 650 g/ml ，避光保存于 - 20）、 PBS （pH 保

11、存于 4） 、秋水仙胺、秋水仙素。3. 器材：培养瓶、移液器、枪头、 5ml 注射器、试管、离心管、封口膜、微量移液器、 Tips 、烧杯、废液缸、细胞培养设备、倒置显微镜、台式离心机、水浴、4冰箱、二氧化碳培养箱、 N2 罐、流式细胞仪、超净工作台。四. 实验步骤（ 一 ）S 期同步化方法（ TdR 双阻断法）（1）取指数生长期细胞。（2）第一次阻断：将对数生长期细胞的培养基换成含 2mmol/L 的新鲜 TdR 培养液。（3）37 、 5%CO二 氧化碳培养箱 中培养 12h（4）第一次 释放 ：弃去含有胸腺嘧啶核苷的培养基，用Hanks 液对贴壁细胞漂洗 23次，并更换不含 TdR的新鲜

12、培养基，继续培养 16h。（5）第二次阻断：弃去培养液，再加入浓度为 2mmol/LTdR 的新鲜培养基， 37 、 5%CO培 养 12h 。(6) 第二次释放：重复第( 4)步骤，此时的细胞大部分出去 G1/S 期边界，同步化细 胞随时间推移逐渐进入 S 期。二) M期同步化方法(振荡收集法)(1) 取生长于占瓶底面积 60% 80%的细胞一瓶，轻轻摇晃或拍击培养瓶，使松动细胞 脱落而悬浮在培养液中，并用离心管收集。(2) 用 Hank 洗涤 2次，漂洗液收集到离心管。(3) 600rpm 离心 5分钟，并用培养液将细胞浓度调整为105 个/ml 接种于培养瓶。( 三 ) 利用流式细胞术分

13、析细胞周期时相(1) 将细胞传代培养至指数生长期，吸弃细胞培养上清，用 Hanks 液洗涤细胞一次， 胰酶消化细胞，完全培养基终止，收集细胞。 1200rmp 5min 离心，弃去上清。(2) 4 预冷的 PBS漂洗细胞沉淀 2次， 1500rmp离心 5分钟，收集细胞。(3) 快速将细胞悬液注入预冷的 70%乙醇中，封口膜封口。 4固定过夜(可长至 2 周)。(4) 1500rmp 离心 5 分钟去固定液，收集固定细胞，用PBS使细胞重悬并转至试管中吹打均匀(防止细胞破碎)。 PBS漂洗 2 次。(5) 细胞染色液配制： 40加碘化丙啶( PI )母液( 2 mg/ml )： 100RNA酶

14、 A母液 (10 mg/ml )： 1PBS =25： 10： 1000。(6) 细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(1)重悬，使上机时细胞通过率为 200 350 Cell/s 。(7) 用 300 目(孔径 4050 m)的筛网过滤于流式上机管中，上机检测。(8) 样品分析测定及打印。( 四 ) 秋水仙素阻抑法(1) 将细胞培养至指数生长期。(2) 加入秋水仙素，使培养基最终浓度为g/mL，作用 67 小时。(3) 收集细胞， 800rpm离心 510 分钟，弃去上清，沉于管底的细胞即为M期细胞。( 五 )N2 阻断法(1) 将细胞传代培养至指数生长期。(2) 将培养瓶置于 N

15、2罐中并通入适量 CO2(约相当于罐中体积的 5) 。(3) 关闭 N2罐，连接 N2管子和压力表，慢慢向罐中充入氮气直到压力为8090 磅英寸 为止。(4) 将 N2装置放在 37培养箱中 1016 小时。次日取出，然后缓缓放出N2(最好放出窗外)。(5) 取出细胞观察同步化效果，并用振荡法收集细胞于离心管中。(6) 800rpm 离心 10 分钟，收集细胞。六) G1 期和 G2期细胞的获得1G2期细胞的获得根据细胞周期测定的数值，使用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化于 G1/S 期交界处 后，使细胞释放胸腺嘧啶核苷后继续培养。其培养时间应大于 S 期时间并小于 S期与 G2期总和的时间。

16、然后先用振荡收集法使已进入M期的细胞脱落瓶壁，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为G2期细胞。2G1期细胞的获得(1) 向用胸腺嘧啶核苷双阻断法获得的细胞中加入一定量的培养基，继续培养大于S+G2+M期小于一个周期的时间即可获得 G1期细胞。(2) 向细胞中加入 缺乏异亮氨酸 的培养基进行培养，培养时间 超过一个细胞周期 ，即可 获得 G1 期细胞。Common methods for mammalian cell cycle synchronization.MethodSynchrony inducing agent or treatmentmecha

17、nism of actionCell cycle stage blockedChemical/pharmacolLovastatinInhibition of HMG-CoAEarly G1ogical inhibitionreductase (cholesterolof DNAsynthesis) and thereplication/syntheproteasomesis or mitoticMimosineInhibitionLate G1;spindle formationof thymidine,G1/SMitogen or growth factor withdrawalDensi

18、ty arrestbiosynthesis, inhibition ofCtf4/chromatin bindingThymidineTdRExcess thymidine- induced feedback inhibition of DNA replicationG1/SAphidicolinInhibition of DNA polymerase- and DNA polymerase- G1/SHydroxyureaInhibition of ribonucleotide reductaseG1/SColchicineColcemideInhibition of microtubule polymerizati