血液学及检验试验教学笔记

1、实验十三 自溶 +纠正、高铁血红蛋白还原试验、 Coombs 试验实验一 自身溶血试验及其纠正试验目的】autohemolysis test and correcting test掌握自溶 +纠正、高铁血红蛋白还原试验、 Coombs 试验的方法及结果判断及临床应用1. 原理：RBCRBC 因耗能， 体积增大而破正常人有轻微的溶HS 、非遗传性球形 RBC 溶血性贫血，自身溶血孵 RBC 能RBC 供应正常自身溶血不同程度纠葡萄糖、2. 器材和试剂：（1）无菌 0.556mol/L （100g/l ）葡萄糖液（2）无菌 N.S（3）1g/l 肝素水溶液（4）氰化高铁 Hb转化液（5）无菌小瓶（

2、 5ml），内加 0.3ml 肝素， 50烘干灭菌（6）无菌注射器和吸管3. 步骤和方法（1）试管中加葡萄糖 20mg，109mol/L 枸橼酸钠液 0.2ml ，血 1.8ml（2）125g 离心 5min，调血细胞血浆为 1 1。（3）取抗凝血 1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各 0.5ml ， 混匀， 37水浴 3h。（4）取血 0.1ml ，加磷酸盐缓冲液 10ml，2min后， 635nm比色得吸 光度为 SA。（5）用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为B。3取 0.1ml+9.9mlHb 转化液血浆 0.2ml+4.8mlHb 转化液540nm比色，计算溶血率1 R

3、BC 比容未保温全血管读数 4测定管读数 100（ % ）注：未保温全血管稀释 100倍，测定管稀释 25倍，故乘以 4。4. 临床意义：正常人：应 75%；杂合子：多在 74 31%；纯合子：多 30%。5. 注意事项：RBC比积 30%时，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。 以 ACD作抗凝剂时，其与血液之比为 1： 9，过量则 pH下降。 一般要求 St 比 B大 8倍以上。不稳定 Hb易被氧化造成假阳性。（2） 几种溶血性疾病的结果：疾病NaCI葡萄糖ATPHS明显纠正明显纠正G-6-PD缺乏正常or稍部分纠正部分纠正HK 缺乏稍纠正纠正不稳定 Hb 病稍纠正纠正PK 缺乏不纠正

4、明显纠正AIHA 伴球形RBC 增多不定明显纠正实验二 高铁血红蛋白还原试验methemogobin reduction test MHb-RT1. 原理：当 RBC内 G6PD含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成的 NADPH可作为 MHb 的还原酶的辅酶，在美蓝的参与下， MHb被还原成 Hb。如 G6PD缺乏，还原速度 减慢，或不能还原。通过测定还原速度间接反应 G6PD的活性。2+b（Fe2+ ）亚硝酸钠MHb （Fe3+ ）H+Hb （Fe2+ ）美蓝2. 器材与试剂（1）亚硝酸钠和葡萄糖混合液（2）亚甲蓝（3）磷酸盐缓冲液3 方法及计算：（1）试管中加葡萄糖 20mg，109mol/

5、L 枸橼酸钠液 0.2ml ，血 1.8ml 。 125g 离心 5min，调血细胞血浆为 1 1。（2）取抗凝血 1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各 0.5ml ，混匀，37水浴 3h3）取血 0.1ml ，加磷酸盐缓冲液 10ml，2min 后， 635nm比色得吸光度为 SA。高铁血红蛋 白还原率 （% ）SA B100%4）用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为B。= 1 - St B4. 参考值： 正常人：应 75%； 杂合子：多在 74 31% 纯合子：多 30%。5. 注意事项：RBC比积 30%时，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。 以 ACD作抗凝剂时，其

6、与血液之比为 1： 9，过量则 pH下降。 一般要求 St 比 B大 8倍以上。不稳定 Hb 易被氧化造成假阳性。3. 临床意义：设问实验三 抗人球蛋白试验 Coombs test1 原理： 不完全抗体（ IgG）在盐水介质中不能使 RBC凝集，只附着在 RBC上 （致敏 RBC），此种抗体是人类球蛋白，如果用家兔抗人球蛋白加入，可使致 敏 RBC发生凝集。 用于检测体内不完全抗体的试验。 有间接重和点直接试验两种。2 方法与步骤间接抗人球蛋白试验： 检查血清中的不完全抗体D-RBC待检血清致敏RBC抗人球蛋白 RBC 凝集管号PDd待测患者血清2滴10%OD- RBC1滴1滴抗 D 血清1滴

7、1滴10%Od- RBC1滴混匀， 37水育 1h，810倍生理盐水洗涤 3次以上， 留压积 RBC，加抗人球蛋白血清 1滴， 转动试管混匀，观察结果。P管凝集：血清中含有不完全抗体。如检查孕妇血清中有无不完全抗体。 直接抗人球蛋白试验： 检查 RBC上的不完全抗体直接抗人球蛋白试验：已致敏 RBC抗人球蛋白临床意义 ：C 上含有不完全抗体。如检测新生儿脐血RBC 凝集RBC 上有无来自母体的抗体。实验小结：实验十四 血小板功能试验， PF3aT 试验检测一、血小板粘附试验( platelet adhension test，PAdT )常用方法：玻球法、玻璃滤器法、玻柱法 原理 BPL可粘附于

8、带负电荷的非生理性物质表面如金属、 玻璃等血液在特 制的玻球内转动， BPL可粘附于玻璃球内表面故血液在玻球内转动后 BPL数 比较转动前后血液中 BPL数可了解 BPL粘附功能 。 器材、试剂 玻球、转动装置、显微镜、牛鲍计数板、枸橼酸盐抗凝剂、血小 板稀释液等。 操作 1取血 1.8ml 0.2ml 枸橼酸加入玻球旋转 3rpm/min 15min 2计数粘附前后血小板数，算出粘附率。 临床意义 1、PAdT增高：见于血栓前状态和血栓性疾病。2、PAdT减低：见于血管性血友病、巨大 BPL综合征、 BPL无力症、尿毒症、异 常蛋白血症、 MDS、AL 等。 参考值 45.34% 79.78

9、%、血小板聚集试验( platelet aggregation test ,PAgT) 原理 光束 透过的光致聚剂PRP致聚剂PRP光束记录光浊度变化血小板聚集曲线 器材、试剂 血液凝聚仪、血小板聚集诱导剂： 3.0 mol/L 腺苷二磷酸钠盐 （ADP）、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素、花生四烯酸。 临床意义 1、增高：反映血小板聚集功能增强。见于血栓前状态和血栓性疾病。2、减低：反映血小板聚集功能减低。见于血小板无力症、贮存池病、尿毒症、 肝硬化等。BPL聚集分析参数： 2A、4A、 MA、TMA、 T50%、Dt，PF3aT)、血小板第 3 因子有效性检测( platelet factor

10、3 acailability test记录凝固时间原理 PF3 是凝血的重要成分；当 PF3缺乏时复钙时间延长。本试验是利用正 人和病人 PRP血浆以及 PPP血浆相互配合， 以白陶土作为活化剂测定各组标本的RT比较各组差异而了解 PF3有否缺陷。组别病人血浆 mL正常人血浆 mL40%g/L白陶土悬 液(mL)PRPPPPPRPPPP10.10.10.220.10.10.230.10.10.240.10.10.2病PRP1病PPP2病PPP3正PPP4正PPP正PRP病PRP正PRP 操作 白陶土悬液 临床意义 超过 5秒为 PF3有效性减低见于： BPL第3因子缺陷症、 BPL无力症、巨大

11、 BPL 综合征等。 参考值 复钙时间 1 组较 2 组延长低于 5 秒 四、实验小结：实验十五 PT 、KPTT、 SCT、因子筛选试验【目的】 掌握 PT、KPTT、 SCT、因子筛选试验的原理、方法及结果判断。 一、硅化的凝血时间测定（ SCT）【原理】 由于本法采用硅化的用品，硅管内壁可以阻止接触活化过程，故硅管 法的凝血时间较普通试管法为长。【器材】 8mm直径玻璃试管（硅化管） ，灭菌注射器（硅化） ，水浴箱，秒表， 碘酊棉球，乙醇棉球。【操作】1准备试管 取 8mm直径的硅化玻璃试管 3 支，编号为 1、2、3，置于 37 水浴箱中预温 3min。2采血并计时 常规静脉采血 3m

12、l（自血液流入针头，即开始计时） ，去掉 针头后分别沿试管壁缓缓注入 1ml血液于 3支试管内，置于 37水浴中。3间隔计时 3min 后每间隔 0.5min ，将第 1 支试管倾斜 1 次（倾斜 30 度）， 直至血液凝固。再观察第 2 支试管，第 2 支试管血液凝固后再观察第 3 支试管。 第 3 支试管血液凝固时，立即停止计时。4计算 计算从血液进入针头到第 3 支试管血液凝固所需要的时间，即凝 血时间 。【注意事项】 硅管法的注意事项与试管法相同。【参考值】 15 32min。二、血浆凝血酶原时间测定（ PT） 【原理】 在受检血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固的时间， 即

13、为血浆凝血酶原时间（ prothrombin time , PT ）。本试验是外源性凝血系统 常用的筛检试验。【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。【试剂】125mmol/L氯化钙凝血活酶试剂。 商品试剂， 用前按要求用蒸馏水溶解混 匀。2正常人冻干混合血浆。多为商品试剂，用25 个以上正常人血液经109mmol/L 枸橼酸钠抗凝（血液与抗凝剂之比为 91），3000r/min 离心 10min， 分离血浆后，混合分装为每瓶 1ml，冻干保存。3109mmol/L枸橼酸钠溶液。【操作】1采血并分离血浆 常规静脉采血 1.8ml ，加入含有 109mm

14、ol/L枸橼酸钠 溶液 0.2ml 的硅化试管或塑料管中，充分混匀， 3000r/min 离心 10min，分离血 浆。2平衡温度 将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆置室温中 15min。3预温 将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆、 待测血浆，置 37 水浴中预温 5min。4测定 取小试 1 支，加入正常人混合冻干血浆 0.1ml ， 37 水浴预温 30s，再加入预温的 25mmol/L氯化钙凝血活酶溶液 0.2ml ，混匀，立即启动秒表 计时。5计时 不断地轻轻倾斜试管，观察试管内液体的流动情况，当液体流动 缓慢趋于停止时，终止计时，并记录所需时间。重复测定 23 次，取其平

15、均值。6测定待测血浆 以同样方法测定待测血浆的凝血酶原时间（重复2 3次测定，取其平均值） 。7结果报告 以直接测定的时间（ PT）报告，同时，报告正常混合冻干 血浆 PT。以 PT比值（ PTR）报告， PTR=待测血浆 PT/正常人混合冻干血浆 PT。 以国际标准化比值（ INR）报告， INR=PTRISI （ISI 为氯化钙凝血活酶试剂国际 敏感指数）。【注意事项】1所用试管必须洁净、干燥、无划痕。2采血要顺利，血液与抗凝剂比例（ 9 1）要准确。抗凝要充分，充分混 匀，决不能有血凝块。3采血后宜在 1h 内完成测定， 4冰箱内保存不应超过 4h，20下可保 存 14d， 70下可保存

16、 6 个月。4先测定正常人混合冻干血浆的凝血酶原时间，其结果在正常允许范围内 后才能测定待测血浆。5水浴温度要控制在（ 37.0 0.5 ），温度过高或过低都可影响测定结 果。6血细胞比容（ Hct ）小于 0.2 或大于 0.5 时，抗凝剂的用量应做调整。 抗凝剂（ ml）=（100Hct）血液（ ml） 0.00185。7由于每次使用的氯化钙凝血活酶活性不尽相同，测定的条件也略变动， 故每次测定均需有正常对照。8氯化钙凝血活酶必须注明国际敏感指数（ ISI ）。【参考值】 PT：1113s（超过正常对照 3s 有意义）。PTR：0.85 1.15 。INR：0.8 1.5 。三、活化部分凝

17、血活酶时间测定【原理】 在 37条件下，以白陶土（激活剂）激活、因子，以脑磷脂（部 分凝血活酶）代替血小板第 3 因子，在 Ca2参与下，测定血浆凝固所需的时间。 本试验是内源性凝血系统灵敏和常用的筛检试验。【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化玻璃试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊 棉球，乙醇棉球。【试剂】1109mmol/L枸橼酸钠溶液。2APTT试剂（含白陶土或鞣酸及脑磷脂） 液体试剂混匀后可直接使用， 冻干试剂需用蒸馏水溶解再使用。325mmol/L 氯化钙溶液。4正常人混合冻干血浆多为商品试剂，用 25 个以上正常人血浆经109mmol/L 枸橼酸钠溶液抗凝（血液与抗凝剂之比为91）， 3

18、000r/min 离心10min，分离血浆后，混合分装为每瓶 1ml，冻干保存。操作】1采血并分离血浆 常规静脉采血 1.8ml ，加入含有 109mmol/L枸橼酸钠 溶液 0.2ml 的硅化试管或塑料管中，充分混匀， 3000r/min 离心 10min，分离血 浆。2平衡温度 用蒸馏水溶解正常人混合冻干血浆，于室温下静置 15 min 以上，充分混匀。3预温活化 于试管中加入正常人冻干血浆和 APTT试剂各 0.1ml ，混匀， 37水浴中预温 3 min ，预温过程中，轻轻振摇数次。4加钙计时 于试管中加入预温至 37的 25mmol/L 氯化钙溶液 0.1ml ， 混匀，并立即计时，置水浴中不断振摇。 20s 后，不时地缓慢倾斜试管，观察试 管内液体的流动状态，当液体停止流动时停止计时，记录时间，重复检测23次，取平均值。5测定待测血浆