细胞因子检测

1、左大明左大明 2 一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分 子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。 v白细胞介素白细胞介素(interleukin, IL) v干扰素干扰素(interferon, IFN) v肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) v集落刺激因子集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) v生长因子生长因子(growth factor, GF) v趋化因子趋化因子(chemokine) 3 优点：优点：敏感、可靠；敏

2、感、可靠； 缺点：缺点：需长期饲养细需长期饲养细 胞、检测耗时长、步胞、检测耗时长、步 骤繁杂。骤繁杂。 1 不同的不同的CK具有不同的具有不同的 生物学活性，选择生物学活性，选择CK 独特的生物学活性，即独特的生物学活性，即 可检测。可检测。 细胞增殖细胞增殖/抑制实验抑制实验 细胞病变抑制实验细胞病变抑制实验 细胞毒实验细胞毒实验 细胞趋化实验细胞趋化实验 生物学检测法生物学检测法 2 利用抗体对抗原表位的利用抗体对抗原表位的 识别，测定的是可溶性识别，测定的是可溶性 细胞因子的抗原性。细胞因子的抗原性。 ELISA RIA FIA ELISPOT 。 免疫学检测法免疫学检测法 优点：优点

3、：方便、迅速方便、迅速 缺点：缺点：价格昂贵，结价格昂贵，结 果仅代表果仅代表CK的量而非的量而非 活性，敏感性较低。活性，敏感性较低。 3 利用基因探针，检测特利用基因探针，检测特 定细胞因子基因表达，定细胞因子基因表达， 即即mRNA水平。水平。 斑点杂交斑点杂交 Northern印迹印迹 细胞和组织原位杂交细胞和组织原位杂交 RT-PCR 。 分子生物学检测法分子生物学检测法 局限性：局限性：仅能检测基因表仅能检测基因表 达情况，不能直接提供有达情况，不能直接提供有 关细胞因子的浓度和活性，关细胞因子的浓度和活性， 只用于机制探讨。只用于机制探讨。 4 待检样品待检样品( (细胞上清细胞

4、上清) ) 指示细胞（指示细胞（CTLL-2CTLL-2） IL-2IL-2依赖细胞系依赖细胞系 按不同稀按不同稀 释度加入释度加入 3737C C，16-2016-20小时小时 加入加入3 3HTdRHTdR（1-51-5 CiCi） 3737C C，4-64-6小时小时 收集细胞收集细胞 测定测定 5 待检样品（细胞上清）待检样品（细胞上清） IFN-IFN- 指示细胞（指示细胞（wishwish） 按不同稀按不同稀 释度加入释度加入 3737C C，4 4小时小时 3737C C，24-4824-48小时小时 弃取上清，加入弃取上清，加入VSVVSV( (水泡性口炎病毒水泡性口炎病毒)

5、) 观察细胞病变（镜检或比色）观察细胞病变（镜检或比色） 6 Using CFSE to track CML progenitor proliferation SDMSDM + Glivec 7 Calculation of Proliferative Index (P.I.) CFSE - 4 3 2 1 0 The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for

6、comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments. 8 Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric) 9 Chromium-51 (51Cr) release assays 10 计数受趋化细胞计数受趋化细胞 趋化因子趋化因子 细胞细胞 趋化实验示意图趋化实验示意图 微孔微孔 滤膜滤膜 11 用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的 抗原或抗体反应，使

7、微量的、不可见的反应成为抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为 可见的或可测定的。可见的或可测定的。 免疫标记技术免疫标记技术 12 高通量细胞因子检测高通量细胞因子检测 vCBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合 来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养 液、液、EDTAEDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。血浆、血清样本中被检测物质的量。 其采用夹心法分析策略，与传统的其采用夹心法分析策略，与传统的ELISAELISA分分 析技术相比

8、，此方法可以同时检测多项指标。析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。 用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出 被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的 限制，而且可以得到一个样本的多个数据。限制，而且可以得到一个样本的多个数据。 13 www.themegallery. com LOGO Cytokine network 14 www.themegallery. com LOGO 15 www.themegallery. com LOGO 16 CBA原理示意图原理示意图 17 www.themegallery. co

9、m LOGO 18 www.themegallery. com LOGO v Lab Invest 2003, 83:11311146 cytokine bead arrays(CBA) 19 ELISPOT(酶联免疫斑点实验酶联免疫斑点实验) ) vELISPOTELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子 的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细 胞因子。实验中每个斑点（胞因子。实验中每个斑点（spotspot）是激活的淋巴）是激活的淋巴 细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细细胞分泌的细胞因子区域，

10、代表一个活性淋巴细 胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗 原的反应能力。原的反应能力。 v优点：优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。 可检测到百万分之一阳性细胞率可检测到百万分之一阳性细胞率; ; 单细胞水平、单细胞水平、 活细胞功能检测活细胞功能检测; ; 操作简便，可进行高通量筛选。操作简便，可进行高通量筛选。 1.特异性单抗包被在培养板孔底部；特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭能结合单抗的其他部位；封闭能结合单抗的其他部位； 3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞加入细胞及刺激物培养，阳性细胞

11、 分泌的细胞因子被单抗捕获；分泌的细胞因子被单抗捕获； 4.移出细胞，洗涤；移出细胞，洗涤； 5.加入生物素标记的二抗；加入生物素标记的二抗； 6.加入酶标链霉亲和素；加入酶标链霉亲和素； 7.加入显色底物，在酶的催化分解下，加入显色底物，在酶的催化分解下， 产生不可溶的色素，就近沉淀在局产生不可溶的色素，就近沉淀在局 部的膜上形成斑点；部的膜上形成斑点； 8.斑点计数（可人工计数，也可用自斑点计数（可人工计数，也可用自 动读板仪计数），数据处理，结果动读板仪计数），数据处理，结果 分析。分析。 ELISPOT 21 22 应应 用用 v 移植研究移植研究-allograft rejectio

12、n -allograft rejection v 疫苗开发疫苗开发- -亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 v Th0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2细胞转换分析细胞转换分析 v 自体免疫研究自体免疫研究- -免疫调节及免疫治疗研究免疫调节及免疫治疗研究 v 癌症研究癌症研究- -肿瘤反应肿瘤反应T T细胞作用细胞作用 v 过敏机制探讨过敏机制探讨-IL-4-IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参 与过敏机制之细胞因子的研究与过敏机制之细胞因子的研究 v 传染疾病研究传染疾病研究-Lyme disease, Chla

13、mydia infections, -Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, sclerosis, 等等 Medium PHA Peptide 1Peptide 21 Peptide 47 GzB HIV- peptide recall patient B IFN- HIV-peptide specific reca

14、ll response shows dissociated production of IFN- and GzB Kleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392 24 www.themegallery. com LOGO ELISPOT 和和 ELISA的区别的区别 ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA ，又突破传统，又突破传统 ELISA ELISA 法，是定量法，是定量 ELISA ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最大的不同技术的延伸和新的发展，它们最大的不同: : 1.ELISA 1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测

15、定吸光度，与标准曲线比较得出可通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可 溶性蛋白总量溶性蛋白总量( (整体水平整体水平);ELISPOT);ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可也是通过显色反应，在细胞分泌这种可 溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数 斑点或通过斑点或通过ELISPOTELISPOT分析系统对斑点进行计数，分析系统对斑点进行计数，1 1个斑点代表个斑点代表1 1个细胞，从个细胞，从 而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（单细胞水平单细胞

16、水平）；）； 2.ELISPOT2.ELISPOT比比ELISAELISA更敏感。更敏感。 ELISPOTELISPOT技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官 移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫 苗和药品的研发与检测等。苗和药品的研发与检测等。 25 www.themegallery. com LOGO 胞内细胞因子的检测胞内细胞因子的检测 LPS活化单核细胞内活化单核细胞内TNF-的测定的测定 R1：淋巴细胞；：淋巴细胞；R2：单核细胞：单核细胞 26 TNF- 的诱生和检测的诱生和检测 v主要由主要由单核单核/ /巨噬细胞巨噬细胞及其他多种细胞产生，能及其他多种细胞产生，能 使杀伤肿瘤细胞使杀伤肿瘤细胞; ; vTHP-1THP-1( (人单核细胞系人单核细胞系) )在在LPSLPS( (脂多糖脂多糖) )刺激下可刺激下可 分泌分泌TNF-TNF- ; ; vL929L929( (小鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞) )可被可被THP-1THP-1分泌的分泌的TNF-TNF- 杀伤，且细胞的死亡率与杀伤，且细胞的死亡率与TNF-TNF- 活性成正比活性成正比; ; v四甲基