第八章、荧光分光光度法

1、 较高激发态较高激发态 基基 态态 吸收能吸收能 量受激量受激 光辐射光辐射 退激退激 分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量 荧光荧光荧光分析法荧光分析法 磷光磷光磷光分析法磷光分析法 采用高灵敏度的检测系统可大大提高采用高灵敏度的检测系统可大大提高 灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法 低低24个数量级个数量级 激发激发 发射荧光发射荧光 强强 强强 光照激发光照激发 去激发光去激发光 * * n 基态单重态 第一激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8 基

2、态单重态基态单重态 第一激发三重态第一激发三重态 自旋平行自旋平行 三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为 10-41S T1 S0 ISC VR VR IC 吸光吸光 吸光吸光 S0 S1 S2 VR：振动驰豫：振动驰豫 IC：内部转换：内部转换 ISC：系间窜跃：系间窜跃 发光 T1 S0 ISC VR VR IC 吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 图图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图 S0 S1 S2 VR：振动驰豫：振动驰豫 IC：内部转换：内部转换 ISC：系间窜跃：系间窜跃 * 易产生荧光易产生荧光 n * 易产

3、生磷光易产生磷光 T1 S0 ISC VR VR IC 吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光 图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图 S0 S1 S2 VR：振动驰豫：振动驰豫 IC：内部转换：内部转换 ISC：系间窜跃：系间窜跃 VR 发荧光的分子数发荧光的分子数 激发态分子总数激发态分子总数 if f f KK K 0.11 205 278 0.29 286 310 0.46 365 400 苯苯 萘萘 蒽蒽 350菲菲 线状环结构比非线状线状环结构比非线状 结构的荧光波长长结构的荧光波长长 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，芳香族化合物因具有共轭

4、的不饱和体系， 多数能发生荧光多数能发生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定法测定 3，4 - 苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物 o coo - o o - coo - o o - 荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两 个环固定在一个平个环固定在一个平 面上，具有平面结面上，具有平面结 构，强荧光物质构，强荧光物质 酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两 个环固定，不能很个环固定，不能很 好的共平面，为非好的共平面，为非 荧光物质荧光物质 反式：平面构型 强荧光体 顺式：非平面构型 非荧光体 C=C H H C=C H H N OH N OH M OHO

5、 _ OH H+ _例：例： 苯酚苯酚 离子化后，离子化后， 荧光消失荧光消失 pH1有有 荧光荧光 pH13 无荧光无荧光 例：例： 苯酚苯酚 有荧光有荧光无荧光无荧光 OHO _ 另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性 荧光池 荧光 强度 检测器 I I A 0 lg 将上式展开 ! 3 )3 . 2( ! 2 )3 . 2( 3 . 2 32 0 AA AII ff ! 3 )3 . 2( ! 2 )3 . 2( 3 . 2 32 0 AA AII ff 当当A0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可 忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化 =2.3 当

6、当A0.05时，时， 光源第一单色器 液池检测器 第二单色器 检测器放大器及记录器 与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同 两个单色器两个单色器 检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角 应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光 源，可发射源，可发射250800nm 很强的连续光源很强的连续光源 I 固定固定 获得方法：先把第二单色器的波获得方法：先把第二单色器的波 长固定，使测定的长固定，使测定的 I I 固定固定 获得方法：先把第一单获得方法：先把第一单 色器的波长固定，使激色器的波长固定，使激 发的发的 图 吸收峰 荧光峰 磷光峰 x CxC )(1QCK I I f 后 前 猝灭

7、剂加入前 的荧光强度 猝灭剂加入后试 液的荧光强度 常数 猝灭剂浓度 )()( )( QCMC MQC K f 比较 Cs Cx I I fs fx 0 0 ffs ffx fs fx II II Cs I I CsCx 荧光强度减去空白后若有试剂空白，测得的 VB2 又称核黄素，是一种生长又称核黄素，是一种生长 促进剂，常存在于动物肝脏、肉促进剂，常存在于动物肝脏、肉 类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和 海藻中，海藻中， VB2易溶于强酸或强碱易溶于强酸或强碱 性溶液。性溶液。 在低浓度情况下，在低浓度情况下，I= KC，I与与C 呈线性关系，在呈线性关系，在pH67荧光最强荧光最强 在在430440nm蓝光照射下，发出蓝光照射下，发出 绿色荧光，绿色荧光， em = 535 nm下测下测 I ，用标准曲线法测定，用标准曲线法测定 CH HO HO HO N NN NH CH CH CH OH CH 2 2 O O H C H C 3 3 缺VB2会得口角炎、舌炎、 唇炎、脂溢性皮炎 维生素维生素B2 荧 光 形 成 机 制 单重态 第二激发态 第一激发态 三